第三节 全自动免疫组化染色系统

一、导言

抗原修复技术发明以后，现代免疫组化技术才得到了空前的发展。随着病理标本大量增加，免疫组化染色量也呈爆发式增长，临床对免疫组化自动化的需求也日益加剧。但免疫组化自动化的发展比较缓慢，究其原因并非自动化技术不够成熟，而是由于免疫组化是“链式”反应，影响免疫组化染色结果的因素很多，这些影响因素通常环环相扣，而要通过自动化实现免疫组化染色，所需控制的关键细节就更多。

对稳定可靠免疫组化染色结果的要求和越来越多生物标志物的应用促使免疫组化自动化成为病理技术发展的必然趋势。基于不同原理的各类免疫组化自动化系统发展迅速，免疫组化自动化系统的出现是病理组织学技术领域的重要进展和创新。免疫组化实现自动化后染色过程可由电脑自动化控制，使技术员从大量实验中解放出来，减少了人为操作误差的可能性，从而提高了染色的一致性、可重现性和可靠性，推动了免疫组化技术的标准化进程。

二、技术发展历程与特点

1. 技术发展历程

免疫组化自动化技术需要克服的困难很多，其技术发展历程相当艰难而漫长。免疫组化自动化技术的发展属美国最为领先，欧洲其次，其技术发展过程大概可分为以下三个阶段：

第一阶段：原始设计 (1988-1994年)；

第二阶段：实际应用 (1995-2004年)；

第三阶段：改进创新 (2005-2016年)；

各发展阶段的代表产品及性能特点见图1。

2.工作原理

免疫组化染色的操作步骤主要有：脱蜡、水化、抗原修复、一抗、检测系统、显色（DAB或其它染料）、复染、干燥、透明、封片等。免疫组化自动化的原理是利用计算机控制软件模拟手工免疫组化操作步骤，通过条形码、二维码或数字芯片自动数字化识别切片及相关试剂，利用加热元件控制切片孵育/修复温度，使用加样排液系统自动加样和排液，从而将免疫组化染色的部分或全部步骤转移到仪器上，从而实现自动化染色。免疫组化自动化染色系统的工作原理主要分为四大类：

（1）毛细管虹吸原理

毛细管虹吸原理由Dr. David Brigati发明，利用该原理将两张组织切片或一张组织切片和另一张盖片紧密靠近，使其形成能产生虹吸现象的间隙。免疫组化染色过程中使用的试剂可通过这种虹吸现象实现组织覆盖。

（2）液盖膜原理

在每一步滴加试剂前先用油状液体铺满待测组织，然后将试剂滴在油状液体中央，利用试剂比油状液体的比重大而沉到底部的原理，使试剂覆盖组织。同时，油状液体可形成一层保护膜，防止试剂蒸发。

（3）通用系统

通用系统的设计原理及操作步骤与手工操作原理及步骤最为相似，是高度模拟手工操作的一种设计。通用系统又可分为半自动化和全自动化两种方式，半自动化通用系统的脱蜡和抗原修复步骤并非仪器自动完成，而是要通过人工处理或干预，操作步骤和手工操作基本一致。而全自动通用系统的脱蜡和抗原修复步骤由仪器自动完成。

（4）固盖膜原理

在玻片上方设计一种可运动的固盖板，固盖板在试剂孵育过程中会根据设计要求运动，带动玻片表面试剂运动，促进试剂混合均匀，同时也起到减少试剂蒸发和流失的作用。

3. 制造商代表性产品简介

市场上应用较为广泛的代表性产品见表1。

三、国内外行业现状及分析

在国际上，免疫组化自动化行业的发展与其技术的发展息息相关，大致可分成2个阶段。

1.       第一阶段，自由发展阶段（1988-2007年）

在这个阶段，以Dako为代表的免疫组化试剂生产商为了促进其试剂的销售与推广，不惜重金纷纷投入到免疫组化自动化领域。原理各异的免疫组化自动化仪器争相上市。因研发是由免疫组化试剂市场商所主导，所以该阶段半自动通用系统占据主导地位。

2. 第二阶段，并购整合阶段（2008-2016年）

随着免疫组化技术应用的不断发展以及各种靶向药物的上市，免疫组化自动化市场成为资本市场关注的目标。大型制药厂商为了更好地推广其靶向药物，不惜代价收购免疫组化自动化制造商。其中最典型的案例是，2008年1月瑞士制药商Roche公司花费34亿美元收购免疫组化自动化制造商Ventana。通过随后几年的一系列并购，行业内的中小企业逐渐走向衰亡，技术和资源逐渐集中于大型企业，行业内竞争对手越来越少，行业门槛越来越高。同时，市场上半自动通用系统的主流地位也逐步被试剂封闭式的全自动染色仪所替代。

目前，免疫组化自动化行业几乎被极少数外资企业垄断，这些外资企业大多采用“仪器免费、试剂封闭”的商业模式：厂商以极低的价格将免疫组化全自动化仪器销售或租赁给客户，通过技术手段将仪器上使用的试剂进行限制，最终通过销售的仪器配套专用试剂来获取相对较高利润。

国内免疫组化自动化行业现状也非常类似，外资垄断了绝大多数的市场份额。国产免疫组化仪器寥寥可数，其产品仍然停留在仿制技术含量较低国际知名的半自动通用系统上。出现以上行业现状的原因有很多，主要包括：①核心技术仍掌握在极少数几家大型外资企业手中；②影响染色质量的因素很多，如脱蜡效果、抗原修复效果、试剂覆盖组织效果、试剂滴加精准度、温控系统、清洗效果等，外资企业对这些细节的处理技术更加成熟；③研发周期长，一般需5年以上，需要长期稳定的核心研发团队；④研发资金巨大，通常须数千万美元，而国内免疫组化企业往往资金实力有限；⑤免疫组化自动化制造商通常已有多年免疫组化试剂的研发，而国内企业自身往往并未掌握免疫组化试剂的核心技术。

近年来，我国免疫组化自动化行业也取得较大突破，通过设立海外研发中心、技术引进等方式加大该领域的研发力度，国产免疫组化自动化产品相继出现，逐步打破了外企垄断。但我国免疫组化自动化行业的发展之路还很漫长，国内企业任重道远。

四、 结语

21世纪以来，免疫组化自动化得到空前发展，不仅大大提高了工作效率，也提高了免疫组化染色结果的一致性、可重现性和可靠性，极大地推进了质控工作的开展，为免疫组化标准化奠定了基础。但现有的免疫组化自动化染色系统仍存在较多不足，目前免疫组化自动化染色系统只是极大程度地模拟手工免疫组化染色过程，其灵活性始终无法超过操作熟练的技术员，且受多种试剂及抗原修复条件限制，因此短期内自动化染色结果很难超过优秀的手工染色结果。大家应当清醒的认识到：无论选用哪种型号的免疫组化自动化染色系统，人始终是决定染色结果好坏的关键因素。预计免疫组化自动化未来的发展趋势仍将是大通量、流水线工作以及优良稳定的个性化免疫组化染色方案。

第四节 免疫组化国家相关政策法规

一、注册分类管理的逐渐完善

我国体外诊断试剂产业经过30多年的不断探索和发展，技术日趋成熟，监管日趋完善。早期，体外生物诊断试剂按照药品进行管理，但监管并不严格。在2007年4月19日，国家食品药品监督管理局发布的《体外诊断试剂注册管理办法（办法）》（国食药监械[2007]229号）中，将体外诊断试剂归为医疗器械进行管理（血源筛查、采用放射性核素标记的体外诊断试剂除外）。

依据该办法，体外诊断试剂按照产品风险从低到高分为第一类、第二类、第三类体外诊断试剂。境内第一、二、三类体外诊断试剂分别由所在市级、省级（或自治区、直辖市）食品药品监督管理部门以及国家食品药品监督管理局进行审查注册，而境外体外诊断试剂则均由国家食品药品监督管理局负责审查注册。

2013年11月26日，国家食品药品监督管理总局印发了《关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管[2013]242号）及《6840体外诊断试剂分类子目录（2013版）》，详细阐明了体外诊断试剂的产品类别、产品分类名称、预期用途、管理类别，为体外诊断试剂的注册申报工作提供了指导。

根据《体外诊断试剂注册管理办法（办法）》，免疫组化抗体试剂因与致病性病原体抗原、抗体以及核酸等检测相关，也与肿瘤标志物检测相关，属于第三类体外诊断试剂；免疫组化配套试剂，如DAB染色液、抗原修复液等，属于第一类体外诊断试剂（见附表1）。

2013年，国家食品药品监督管理总局医疗器械技术审评中心出台了第一部与免疫组化试剂相关的规范性文件——《免疫组织化学抗体试剂及检测试剂盒注册申报资料的基本要求》，该要求结合临床及病理检测中的应用实践、临床病理专家和生产企业的建议，规范了免疫组化抗体试剂的命名方式，并对说明书书写格式、产品研究及临床等，同时依据不同标志物的临床应用情况，将免疫组化试剂分为A类和B类，并提出注册临床样本数量要求（表1）。

为了更好地推进体外诊断试剂行业健康、有序发展，2014年国家大刀阔斧，对医疗器械行业进行了一次重大变革。2014年3月7日，国家食品药品监督管理总局发布了新版医疗器械的总纲性法规——《医疗器械监督管理条例》（国务院令第650号）。此后，围绕此项条例陆续发布了60多项配套法律、法规文件，对医疗器械行业的管理作了很大调整，包括法规、机构分工、结构人员等，如第一类体外诊断试剂则由原先的注册管理改为备案管理，第二类、第三类体外诊断试剂依然实行注册管理；注册质量管理体系核查也由以往的注册申报前进行，调整为注册申报后开展。新的法规条例更强调企业产品研制、生产、临床、注册申报过程的真实性，并加强对此过程的监督管理。为此，企业必须建立健全的质量管理体系，并确保有效运行。

二、生产监管的逐渐严格

2007年4月28日，国家食品药品监督管理局发布了《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》，首次对归属医疗器械管理的体外诊断试剂的生产及质量管理体系作了详细的规定和指导，并明确要求大部分体外诊断试剂必须具备100,000级净化环境的生产工艺环境，但此项法规对于研制、使用等方面的要求相对比较薄弱。

2014-2015年发布的《医疗器械生产监督管理办法》（局令第7号）和《医疗器械生产质量管理规范附录体外诊断试剂》（2015年第103号公告）等，对体外诊断试剂的研制、生产、经营、使用4个环节提出严格规范要求，进一步明确了使用单位对体外诊断试剂安全管理的义务，避免了执法空白，并加强了监督管理。在新法规的形势下，药监管理部门加大了现场检查频率，日常检查、注册核查、生产许可核查、飞行检查、整改复查等给企业生产管理带来巨大压力，但这同时也促进了企业自身质量管理体系的规范，保障了产品的生产质量及使用安全。在严厉的监管和高频度的检查中，众多不规范企业面临淘汰或被迫出局，而具有行业领先优势的企业将继续推动体外诊断行业的健康发展。

三、行业发展的逐渐规范

2014年起，国家食品药品监督管理总局持续不断地采取一系列监管举措，来规范医疗器械市场。从2014年集中5个月的“五整治”专项行动到2015年的“五整治回头看”、体外诊断试剂质量评估和综合治理工作，足以看出国家总局对医疗器械行业越来越明确的态度，以及越来越严厉的管控措施，其中重点监管和查处医疗器械虚假注册申报、违规生产、非法经营、夸大宣传、使用无证产品等五种行为。后续又发布了《药品医疗器械飞行检查办法》，对企业和使用单位进行无告知的突击性检查，进一步加强了企业和使用单位对自身生产或使用的规范管理。

国家食品药品监督管理总局对医疗器械行业监管逐渐严格、规范，带来的是机遇与挑战并存，体外诊断试剂作为医疗器械分类中极为特殊的一类，在整治、飞检的风暴中逐步成长的同时，也受到了很大的冲击。在一系列的整治活动中，部分类型体外诊断试剂由于品种多、临床难、注册慢，给监管带来极大的困难和分歧。就免疫组化而言，近年来病理学科发展迅速，新的免疫组化标记物不断出现，目前常规用于病理诊断的抗体试剂达到两三百种，当前的注册产品远无法满足临床诊断的日常需求，无证产品的使用又与国家监管相矛盾，用与不用处于两难境地。为解决现状，分类调整势在必行。

放眼国外，免疫组化的分类也经历了漫长的改革演变。在美国，免疫组化产品分类经历了多年的讨论，于1998年，美国食品药品监督管理局(FDA)发布了《Guidance For Submission of Immunohistochemistry Applications to the FDA》。该指南作为FDA免疫组化的管理规范，将免疫组化抗体统分为三大类：绝大多数抗体作为Ⅰ类，主要提供辅助诊断信息；少部分作为Ⅱ类，主要提供预后及预测信息；极少数有临床意义的创新标记物作为Ⅲ类。

我国在结合发展现状不断改革创新的同时，也在借鉴发达国家同类产品的监管模式，2016年 9月21号，器械注册司发布了《关于征求过敏原等三类体外诊断试剂分类调整意见的函》，对免疫组化产品的分类进行重新调整。免疫组化产品中，预期用途包含用药指导、或明确用于肿瘤或遗传病诊断的免疫组化试剂作为三类体外诊断试剂管理，其余的免疫组化产品大多被调整为二类，甚至有部分产品不作为医疗器械管理。这将会是国家食品药品监督管理总局在免疫组化产业注册和监管方面又一个重大改革。

综上可以看出，我国体外诊断行业仍处在不断发展的阶段，近几年来国家对体外诊断试剂的监管逐步规范和加强，在多次专项整顿和调整中，体外诊断试剂市场正逐步朝着规范的方向发展。