第一节 引言

一、微生物检测的发展现状

目前，微生物实验室使用的检测产品，大部分依然以传统方法为基础，首先对标本进行预处理，根据涂片染色的结果，选择合适的培养基进行分离培养；根据菌落特点，选择适当的生化反应或者上自动化仪器进行鉴定；药敏检测则采用纸片法、液体增菌培养法或者直接上自动化仪器进行表型药敏检测。无论是国内还是国际，微生物的检测一直是手工法、半自动化、全自动化共存，以基础微生物方法为主，结合形态学、免疫和分子生物学等辅助手段。

往年认为细菌检测，也就是检测细菌生长分裂的过程，在技术上无法用自动化仪器取代，尤其是标本处理和培养。2016年国内在这方面得到了突破，我国研制出了标本处理和培养自动化的机器人，如百博生物的微生物样本处理智能机器人ET-2000。自动化仪器逐渐贯穿整个临床微生物检测（标本的前处理→微生物培养→鉴定→数据的管理）的全过程，国外多年前已经实现此半自动或全自动过程，但是我国仍处在努力研制的过程中。另外，随着基因诊断技术的发展，微生物检测不再需要增菌培养，直接对标本进行检测的产品逐渐发展起来，尤其是免疫技术和分子生物学技术的应用，为微生物检测提供了很多辅助手段。由于方法学的局限性，临床对于微生物检测产品的提升需求，主要集中在提高检测速度、减少人工操作、加强准确性等方面。另外，对于药敏检测的结果解释、院感控制和耐药分析也提出了越来越高的要求。  

第二节  微生物检测相关政策法规及国标行标的变化

一、微生物检测相关政策法规的变化

总局在2016年2月发布了进一步加强了医疗器械的监督抽验工作的通知，全国各省市响应总局要求，纷纷出台相关政策，加强医疗器械产品的市场监督抽查，涉及微生物检测产品、免疫检测产品、无菌器械、有源器械等近百种产品的各种飞行检查、市场监督抽查层出不穷。2016年医疗器械行业的日常监督抽验及飞行检查频率比往年强度加大，从而也一定程度上规范了生产及经营企业的内部质量体系管理和外部经营管理，但是也存在过度监管的可能，同时导致企业的管理成本也比往年成倍数增长。

2016年4月7日中国食品药品监督管理局开始实施《医疗器械临床试验质量管理规范》，该规范指出按照“四个最严”和“四有两责”要求，采取有效措施，加强监督检查，督促本行政区域内医疗器械临床试验申办者和临床试验机构切实把《规范》的要求落实到临床试验管理的各个环节，保证临床试验过程科学规范，结果真实可靠，受试者合法权益得到充分保障。因此，该规范的实施导致生产企业新产品注册过程中寻找临床实验单位的难度增大。一方面原因是临床单位原属于卫生部及卫生系统监督和管理，对药监系统的相关法律法规不熟悉，目前来说很难按照药监系统的相关法律法规进行规范化操作；另一方面，中国的国情决定了目前解决不了的医务人员不足的困难，医务人员工作量庞大，同时涉及到个人的业务和绩效，临床单位不愿意承担临床试验带来的风险，加大了临床试验的难度。

2016年09月22日总局关于发布医疗器械冷链（运输、贮存）管理指南的公告（2016年第154号），对微生物检测产品的生产、销售和经营无疑是一个沉重的打击。微生物检测产品，主要以培养基为主，具有货值低廉、占用空间大、利润低的特点，并且其储存条件大部分需要2-8℃冷藏或-10℃以下冷冻保存。冷链管理指南的出台无疑给予微生物检测产品一记重拳，自此原本微生物检测产品的生产和经营所带来的微薄利润将再无利可图，微生物检测产品的相关生产及经营企业只能开始寻找别的出路，纷纷往免疫、基因诊断、自动化设备等方向发展。

2016年是我国体外诊断试剂重大变革的一年，近百种法规政策的出台让人应对不暇，给行业的发展带来了强大的冲击，同样也影响着体外诊断试剂重要分支之一的微生物检测。微生物检测的发展逐渐由传统的手工操作转化为自动化，分离鉴定培养基得到进一步发展，同时也引进了简单快速检测的产品。

二、CLSI药敏试验执行标准的变化

我国微生物实验室药敏试验均遵循美国临床与实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的药敏试验标准。随着检测手段的改进及新药物的成果研制，CLSI至少每年都会对药敏试验执行标准进行一次更新。药敏试验执行标准不断更新的目的是为了能够更加精确的预测抗菌药物体内治疗效果，指导抗菌药物合理应用。主要包括概念改变、折点改变、方法改变和药物适应症及使用方法改变等几个方面。  

2017年CLSI在微生物检测方面的标准的变化主要的是药敏试验标准的变化：仅仅使用术语“折点”、不再使用“解释标准”；继续删除过时的药物/重新定位老药；扩充对流行病学界值的定义/讨论；增加肠杆菌科对粘菌素、淋病奈瑟菌对阿奇霉素的流行病学界值；增加了用于肠杆菌科碳青霉烯检测的mCIM新方法；修改了纸片扩散法质控范围（例如：铜绿假单胞菌ATCC27853对头孢吡肟、大肠埃希菌ATCC25922对美罗培南的纸片扩散法质控范围）；修改了大肠埃希菌ATCC27853对美罗培南和金黄色葡萄球菌ATCC29213对泰地唑胺的MIC质控范围；增加一些正在研发中的还没有用于人的新药物的质控范围；扩充了脆弱拟杆菌的MIC问题排除指南；删除了摩根菌对四环素天然耐药等。

药敏试验执行标准的更新基于体内和体外丰富的药理和临床数据，对临床结果报告具有强有力的指示和指导作用。

第三节 显色培养基

随着临床实验室自动化、系统化、精准化步伐的不断迈进，对微生物检测试剂提出了更高的要求，传统的分离培养逐步被免疫、基因诊断、二代测序、质谱分析等新技术取代，传统的分离培养基已不能满足临床需求，显色培养基应运而生。

一、概述

显色培养基是用于微生物的分离鉴定的培养基，其原理是在选择性培养基上加入了适量的带发色及荧光基团的酶底物，发色团（荧光团）与特殊可识别的集团相连。目标微生物产生一些特殊的可水解发色及荧光底物的酶，使得发色和荧光基团释放发出来，从而使目标微生物带上易于辨别的特殊颜色或发出荧光。是利用微生物不同种属代谢所产生酶的差异性，在营养基质中加入相应的特异性显色酶底物以及特定抑制剂，实现对目标微生物的分离和准确鉴定。与传统培养基相比，显色培养基可有效缩短培养时间（仅18~24h就可得到初步检验结果）；降低假阳性率，减少后期鉴定工作量（特异性很高）；酶显色底物显色反应特异性强，菌落外观易于辨认，降低对检测人员技术水平要求。法国研究人员于1974 年首次开发显色培养基，并将其应用于对大肠杆菌的临床检验中，后期应用范围不断扩展，价值日益凸显。有关报道认为：在微生物检验中应用显色培养基技术能够使目标微生物着色后的颜色对比明显，可方便检验人员直接从环节标本培养物中对目的菌进行检测，对多种微生物样本也有良好的快速检验效果，目前在临床样本微生物种类检测中应用潜力巨大。近年来，有研究人员在显色培养基基础上进一步简化改进为快速检测纸片法，在有关微生物菌落总数、链球菌、金黄色葡萄球菌、霉菌、大肠菌群、酵母菌以及李斯特菌等多种微生物的检测实践中均具有快速性快速、准确的优势。

二、显色培养基生产企业的概况

目前国内外对显色培养基的研究比较成熟的公司主要有：法国生物梅里埃公司、意大利Biolife公司、法国CHROMagar（科玛嘉）公司、北京陆桥技术股份有限公司、郑州安图生物、温州康泰生物、青岛海博生物、广东环凯微生物科技有限公司等。

1、Biolife Italiana 公司 Biolife Italiana公司创立于1968年，是一家专业生产微生物培养基的企业，产品广泛使用于临床、工业和研究实验室，已开发出世界标准的创新型微生物培养基并畅销全球，其产品包括微生物培养基和辅料，特别是在干粉显色培养基以及添加剂、微生物鉴定试剂盒等生产制造方面有良好的声誉。该公司是一家生产高品质培养基的企业，是生产临床与食品微生物显色培养基的先驱者，可提供干粉培养基、培养基原料以及添加剂等集成整合服务，尤其在显色培养基方面有显著的优势。产品诸如念珠菌显色培养基（图5.1）、B族链球菌显色培养基（图5.2）、尿道菌显色培养基（图5.3）、抗碳青霉烯革兰阴性菌显色培养基（图5.4）、产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌显色培养基（图5.5）等。

注：红色——B族链球菌；蓝色——肠球菌

2、CHROMagar（科玛嘉） 科玛嘉微生物在1993年由Alain Rambach 成立，他也是科玛嘉显色培养基的开拓者。目前，科玛嘉提供的培养基覆盖临床细菌学、工业微生物学、食品和饮料行业的食源性致病菌，包括沙门菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌O157、B族链球菌、大肠杆菌、李斯特菌、弧菌和假单胞菌。科玛嘉是显色培养基技术创新领域的领导者，通过其高效的全球经销网络提高国际影响力。2013年3月3日科玛嘉发布了筛查无乳链球菌的培养基，见图5.6。该培养基比格拉纳达及CAN更好的灵敏度，在无氧条件下培养24h，用肉眼可观察到一种颜色强烈的紫红色溶血性和非溶血性链球菌，则为无乳链球菌。

3、法国生物梅里埃 生物梅里埃公司是一家专业研究、生产微生物检测产品和自动化微生物检验仪器的全球性的法国公司。1979成功申请第一个显色培养基的专利，Rambach琼脂培养基早在1989年上市，在市面上销售。接着就有其他培养基的陆续推出，其中包括各种普通培养基（干粉、成品、平板）、显色培养基、Count-Tact环境检测平板、API试剂条、VIDAS全自动致病菌分析仪、ATB自动微生物鉴定系统、Leader 50i基因探针化学发光检测仪、NUCLISENS READER核酸扩增自动检测仪、Air IDEAL空气微生物采样器、产气袋及厌氧培养系统、胶乳凝集产品、DENKA SEIKEN诊断血清等。产品覆盖了从细菌增菌、快速筛检、分离增养、染色镜检、生化鉴定及血清鉴定的全过程，其中显色培养基是该公司主要的产品之一。

4、环凯微生物 广东环凯微生物科技有限公司是广东省微生物研究所（隶属于中国科学院广州分院和广东省科学院）属下的国家级高新技术企业。1993年成立，致力于生物安全检测与控制产品的研发、生产和经营，是国内最大的微生物和微生物控制产品生产企业之一。其中微生物检测产品是其主要的产品，种类繁多，如显色培养基、微生物干燥培养基、新型微生物生化鉴定系统和一次性成品培养基等等。环凯新推出的显色培养基有大肠菌群显色培养基，见图5.7-1；单增李斯特显色培养基，见图5.7-2。

5、海博生物 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司2000年2月1日成立，主要专注于微生物培养基的研发和生产，产品包括微生物干粉培养基、颗粒培养基、显色培养基、即用型培养基等各种培养基，是国内微生物产品品种最多的厂家之一。 其生产销售的显色培养基包含有念球菌、阪崎杆菌、大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌显色培养基。

6、康泰生物 温州市康泰生物科技有限公司成立于2000年，是专业从事于微生物体外诊断试剂与仪器研发、生产、销售的“浙江省科技创新型企业”。现有产品注册证150多个，产品主要包括微生物药敏试剂、药敏试纸、乳胶凝集快速诊断试剂、金标痕量快速诊断试剂、培养基、染色液、质控菌株、免疫印迹产品等几大系列。其中各种规格、方法的微生物药敏检测系列产品有200余种，是其主要产品。其新近推出的念珠菌显色培养基，见图5.8。

三、B族链球菌显色培养基

1、概述 B族链球菌（Group B Streptococcus，GBS）又名无乳链球菌，属于革兰阳性菌。正常寄居于阴道和直肠，它是一种条件致病菌，围产期妇女在分娩过程中，新生儿在通过产道时可被感染。其主要危害群体是孕产妇和新生儿。GBS检测在欧美国家（美国、法国、意大利）多为必检项目，近三年我国对该项检测开始日益受重视。GBS现有的检测方法：

（1）细菌鉴定仪法：准确度高，费用较高，不能直接上标本，纯菌培养时间长；

（2）普通培养加生化鉴定法：该法为GBS检测的 “金标准”，其特异性好，但是需要细菌纯培养，鉴定试验繁琐；

（3）分子生物学方法（PCR法）：该法检测快速、敏感，但是假阳性较难排除，对人员和设备要求较高；

（4）免疫学方法（层析法）：该法特异性好，但灵敏度较低；

（5）乳胶凝集法：其特异性好，但细菌纯化培养时间长；

（6）显色培养法：它的灵敏度高、特异性好，可直接上标本，使用方法和传统培养方法相同，无特殊要求，简便易行。 

2、GBS显色培养基的生产产家 目前国内涉及GBS显色培养基的生产厂家有：广州瑞辉生物医疗科技有限公司（2012年正式成立，2015年完成股改，董事长李有生）、珠海迪尔生物工程有限公司、梅里埃(上海)生物制品有限公司、郑州安图生物工程股份有限公司。B族链球菌显色平板（见图5.9）的特点是显色明显，易于区分，结果判断简便；选择、分离、培养、鉴定同时进行，一步到位检测B群链球菌，快捷；与平板检测限相同，灵敏度高；其他细菌、真菌不干扰GBS显色，特异性好；适用于任何标本的GBS检测，尤其适用于围产期GBS筛查。

我国除了少数生产厂家的B族链球菌显色培养基外，该培养基主要还是依靠进口，比较有名要数法国科玛嘉，基本上垄断了整个显色培养基的市场。然而2016年珠海银科医学工程股份有限公司引入了Biolife Italiana公司的显色培养基，它的显色培养基的效果跟法国科玛嘉的产品结果不相上下。

四、小结

显色干粉培养基是近年来发展起来的一种新型培养基，它是将现代化学合成技术、细菌代谢组学与目前尚不可替代的传统方法相结合应用于细菌检验领域的一项新技术。与传统培养基相比，显色培养基克服了传统培养基在各种细菌分离、鉴别、计数等操作过程中比较复杂（需要有经验的技术人员）、敏感性低和特异性差的缺点。显色培养基在检测细菌时，通过观察菌落颜色即能用肉眼对细菌进行定性或定量分析，既缩短了检测时间，又免除了后续生化鉴定的过程，极大提高了工作效率。