结直肠癌是世界第三高发的恶性肿瘤，近年来我国结直肠癌发病率和死亡率正逐年上升，结直肠癌早期治疗效果很好，但由于早期症状隐匿，患者确诊时大多已发展到中晚期，错过了最佳治疗时期。因此急需寻找一种非侵袭性的、快速、简便的诊断方法，早期诊断标志物便是一种很好的方法，但当前诊断结直肠癌的血清标志物仍比较匮乏，常用的如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)等。

外泌体(extracellular vesicles，exosomes)是广泛存在于血细胞、树突状细胞、肿瘤细胞等各类细胞中的囊泡样结构，在生理和病理状态下均可释放，由于EVs含有受体、生物活性脂质、蛋白、核酸等，故其可向受体细胞传递重要的遗传信息，是细胞间信号传递的重要途径，近期许多研究已表明，外泌体内包含的许多重要蛋白可以用于肿瘤的早期诊断，本研究通过分离并检测结直肠癌患者与健康人血清外泌体CEA的浓度，探究血清外泌体CEA用于结直肠癌诊断的可能性。

01

材料和方法

一、材料

1．主要仪器与试剂：

透射电子显微镜(PHILIPS公司)，Zetaview可视化纳米粒度仪(德国Particlemetrix公司)，酶标仪(Thermo Fisher公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CEA试剂盒购自上海武昊公司。血清CEA检测采用美国罗氏公司Cobas e601型全自动电化学发光免疫分析仪及原装试剂。兔抗人HSP70抗体、兔抗人CD63购自美国santacruz公司，羊抗鼠IgG二抗购自美国CellSignaling公司。

2．血清来源：

选择同济大学附属同济医院胃肠外科2015年10月至2016年12月确诊结直肠癌病例血清标本64例，其中男38例，女26例，年龄39～85岁，平均年龄(59±13)岁，其中分为血清CEA正常病例组41例(经电化学发光法检测血清CEA浓度值在正常参考范围内)及血清CEA增高病例组23例。选择同期良性结直肠疾病患者血清标本20例作为良性疾病对照组，其中男9例，女11例，年龄34 ～78岁，平均年龄(57±11)岁。选同期40例同济医院健康体检者作为正常对照组，其中男18名，女22名，年龄19～70岁，平均年龄(48±14)岁，年龄和性别与病例研究对象相匹配。结直肠癌患者诊断标准及分期、分型标准均依据美国肿瘤联合会第八版癌症分期系统[5]，见表1。所有入组患者均空腹采集静脉血5 ml，室温静置30 min后3 000×g离心15min, 分离血清，－80 ℃冷冻保存。本研究经过同济大学附属同济医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书[(同)伦审-KYSB-2015-(10)]。

表1 结直肠癌病例组临床分期情况(例数)

二、方法

1．血清外泌体提取：

血清标本取出室温复溶后，3 000×g离心15 min，去除残留细胞及细胞碎片，吸上清液250 μl至新管，加入ExoQuick试剂63 μl，充分混匀，室温静置30 min，1 500×g离心30min，弃上清，再次1 500×g离心5 min，弃尽上清，所得沉淀即为外泌体外泌体。

2．透射电镜下观察外泌体：

将离心所得的外泌体沉淀物用100 μl的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS)重悬，取20 μl重悬液载样于铜网上，室温静置2 min，用滤纸从滤网侧面小心吸干液体，滴加3%的磷钨酸溶液20 μl，室温下复染3min，用滤纸从滤网侧面小心吸干复染液，双蒸馏水洗涤铜网5次，室温自然干燥后，透射电子显微镜下观察及拍照。

3．Zetaview可视化纳米粒度仪鉴定血清外泌体：

将所得的外泌体沉淀物用100 μl PBS重悬，充分混匀后，将所得样品用PBS进行1∶50 000稀释，并充分混匀，取混匀后样品300 μl上机，用Zetaview可视化纳米粒度仪进行粒径和浓度分析。

4．WesternBlot检测：

采用BCA法对外泌体蛋白定量，根据定量结果调整蛋白浓度，分别取外泌体沉淀物和去除外泌体的血清样品各20 μg，进行Western Blot检测。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(Sodiumdodecyl sulfate-Polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，将蛋白质电转印(4 ℃，250 mA，60 min)至PVDF，室温封闭1 h，分别加入兔抗人CD63和HSP70单克隆抗体(1∶2 000稀释)，4 ℃孵育过夜，次日用1×TBST洗膜，与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000稀释)室温反应60 min，洗膜，利用ECL化学发光剂(CST公司)显影，压片。

5．ELISA法检测血清及外泌体CEA浓度：

去除残留细胞及细胞碎片的血清样本用1×PBS 500倍稀释，外泌体沉淀用100 ml RIPA裂解液在冰上裂解半小时，充分振荡混匀，用1×PBS 3倍稀释。在CEA抗体包被的微孔板分别加标准品，空白对照，各组稀释后的血清及外泌体样品各100 μl，37 ℃孵育60 min，甩掉微孔板中液体，拍干，加入A液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，加入B液37 ℃孵育30 min，洗板5次，加90 μl底物，37 ℃避光孵育15 min，再加50μl终止液，立即在450 nm波长测定。

6．统计学方法：

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计分析，经K-S检验，各组数据呈偏态分布，计量资料采用最小值-最大值(中位数)的形式表示，组间两两比较用Mann-Whitney U检验。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线评价各指标对结直肠癌的诊断效能，各指标曲线下面积比较用Z检验，以P<0. 05作为差异有统计学意义。

02

结果

一、血清外泌体

使用ExoQuick试剂盒对人血清外泌体提取，所有血清样本均提取到淡黄色脂样沉淀，即外泌体沉淀外泌体。

二、血清外泌体的形态特征

1．形态学鉴定：

透射电镜下观察，外泌体提取物均呈圆形或类圆形的小囊泡，直径约40～100 nm，包膜完整，背景清晰，未见细胞碎片，如图1。

图1人血清外泌体透射电镜观察图，箭头所示为外泌体(×46 000倍)

2．Zetaview可视化纳米粒度仪鉴定血清外泌体：

利用Zetaview可视化纳米粒度仪对外泌体悬液内的粒子进行动态检测，结果提示，健康体检者血清外泌体的直径主要集中在40～150 nm，最大分布峰值为95.1nm，占比97.5%，浓度为3.9×1012个/ml，结直肠癌患者血清外泌体的直径主要集中在40～160 nm，最大分布峰值为99.5 nm，占比98.4%，浓度为3.3×1012个/ml，如图2。

图2 正常对照组(A图)　与结直肠癌病例组(B图)　血清外泌体的Zetaview可视化纳米粒度仪粒径分布

3．Westernblot检测外泌体表面标记蛋白CD63、HSP70：

血清外泌体样本中可见明显的外泌体标志物CD63和HSP70的表达条带，而去除外泌体的血清上清液中二者均未能检测到，如图3。

图3 Western bolt检测外泌体表面标记蛋白

三、ELISA法检测结直肠癌病例组、良性疾病对照组与正常对照组血清外泌体CEA浓度情况

ELISA法检测证实人血清外泌体中存在CEA。64例结直肠癌病例组外泌体CEA浓度为(1 056.36～28637.78)pg/ml，明显高于良性疾病对照组(394.61～2 437.83)pg/ml以及正常对照组(610.89～2 076.70)pg/ml，差异有统计学意义(分别U＝124.000，U＝119.000；均P<0.001)；结直肠癌病例组外泌体CEA与血清CEA正常病例组(1056.36～5 832.07)相比，差异有统计学意义(U＝1 002.000，P＝0.042)；血清CEA增高病例组(2 379.32～28637.78)与良性疾病对照组、血清CAE正常病例组及正常对照组相比，差异均有统计学意义(分别U＝68.000，U＝72.000，U＝62.000，均P<0.001)；血清CEA正常病例组外泌体CEA与良性疾病对照组和正常对照组相比，差异有统计学意义(U＝113.000，U＝119.000；均P<0.001)，见表2。

表2 各组间CEA结果比较(pg/ml)

四、ELISA法检测结直肠癌病例组、良性疾病对照组与正常对照组血清CEA浓度情况

ELISA法检测41例CEA正常病例组血清CEA浓度为(15 298.01～75938.02)pg/ml，与良性结直肠疾病患者血清CEA浓度(31144.97～58 632.76)pg/ml比较差异无统计学意义(U＝405.000，P>0.05)，与健康对照组血清中CEA浓度(9 688.32～57950.80)pg/ml比较差异也无统计学意义(U＝664.000，P>0.05)；血清CEA增高病例组(26 704.16～578 230.74)与良性疾病对照组、血清CAE正常病例组及正常对照组相比，差异均有统计学意义(分别U＝56.000，U＝34.000，U＝48.000，均P<0.001)，见表3。

表3 各指标对诊断结直肠癌的效能比较

五、血清外泌体CEA对结直肠癌辅助诊断价值

图4利用ROC曲线分析外泌体CEA浓度对结直肠癌的辅助诊断效能，结果显示，血清外泌体CEA对结直肠癌诊断的ROC曲线下面积为0.954(95% CI＝0.919～0.988)，血清CEA对结直肠癌诊断的ROC曲线下面积为0.636(95% CI＝0.531～0.742)，二者相比有统计学意义(Z＝5.58，P<0.01)，说明血清外泌体CEA对结直肠癌的诊断效能优于血清CEA，当血清外泌体CEA的cut-off值为1648.51 pg/ml时，诊断效能最佳，此时其诊断结直肠癌的敏感度为84.4%，特异度为97.5%，表明检测外泌体CEA浓度是诊断肠癌的一项良好指标(表3)。

图4 外泌体CEA对结直肠癌的诊断效能

03

讨论

目前，外泌体分离及纯化方法国际上尚无统一标准，各种方法间提纯的产量、纯度及颗粒性状的差异较大，都存在技术上的制约，目前对外周血中外泌体常用的分离方法主要有超高速差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、聚合沉淀法、免疫分离法、微流控技术和色谱法等[6,7]，其中超高速差速离心法是金标准，但耗时、回收率低，尤其对血浆或血清这类黏性生物体液的分离效率较低，我们选用了快速简便的ExoQuick试剂盒来分离人血清样本中的外泌体，并用于后续研究。

图1显示透射电镜下观察，外泌体呈圆形或椭圆形，包膜完整，背景清晰。Zetaview可视化纳米粒度仪检测结直肠癌患者外泌体直径主要集中在40～160 nm，最大分布峰值为99.5nm，占比98.4%，浓度为3.3×1012个/ml，高于文献报道[8,9,10]。虽然外泌体所含成分根据细胞及组织来源不同而有差异，但所有的外泌体都包含膜转运蛋白和膜融合蛋白(GTPases、Annexins和Flotillin等)、热休克蛋白(HSP70、HSP90等)、四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD82等)、参与多囊泡体生物合成的蛋白质(Alix和TSG101等) 以及脂质相关蛋白等[11]。本研究选用热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)和四跨膜蛋白CD63作为血清外泌体的鉴定指标，我们通过western Blot检测到了外泌体中这两种蛋白质的存在，同时也印证了ExoQuick试剂盒抽提血清外泌体方法的可行性。

大量研究表明，外泌体参与肿瘤的发生、发展及转移，由于外泌体所含蛋白质或核酸等内含物可有效反应来源细胞的真实特征和状态，所以外泌体可能为肿瘤提供可靠的早期诊断标志物及特异性治疗靶点[12,13,14,15]，癌胚抗原CEA作为肿瘤标志物常被用于结直肠癌的筛查，但研究发现，术前血清CEA升高的患者在接受治疗时常已发生微小转移灶，所以血清CEA水平升高可能预示结直肠癌患者治疗后复发或转移的发生，对肿瘤早期诊断并不敏感。为了探寻结直肠癌诊断更好的标志物，本研究分离结直肠癌患者血清外泌体，用ELISA法检测到外泌体CEA浓度，证实人血清外泌体中存在CEA蛋白，为进一步研究探讨外泌体CEA在结直肠癌诊断中的应用价值，我们通过ELISA法分别检测结直肠癌病例组、同期良性疾病对照组及正常对照组血清及外泌体CEA浓度。表3中结果显示，结直肠癌病例组外泌体CEA浓度明显高于良性疾病对照组及正常对照组，且血清CEA正常病例组外泌体CEA浓度也明显高于良性疾病对照组及正常对照组，而血清中CEA浓度在血清CEA正常病例组与良性疾病对照组及正常对照组间却无显著差异，提示血清外泌体CEA检测可增加结直肠癌患者临床诊断的敏感性。ROC曲线分析发现，血清外泌体CEA浓度对结直肠癌诊断的ROC曲线下面积为0.954(95% CI＝0.919～0.988)，血清CEA的曲线下面积为0.636，明显低于外泌体CEA(Z＝5.58，P<0.01)，提示与血清CEA检测相比，血清外泌体CEA对结直肠癌的诊断效能更优，但由于CEA是一个特异性较差的肿瘤标志物，在其他空腔脏器肿瘤中也会升高，如胃癌、肺癌等[16]，因此，在结直肠癌的诊断中应排除有无其他肿瘤或疾病的影响。