王兆强 陈正斌 包静 张钰婷
(澳斯邦生物工程有限公司)

2000年，迎接新千年之际我应邀撰写了《酶免试验的自动化与网络化》一文，介绍传染病原的酶免检测自动化分析。彼时正是PCR检测刚刚进入欧美的临床和血液筛查市场，大家关心的是蛋白免疫分析能否将被PCR替代、如何快速发报告等等。后来这篇文章在中国网络上广泛传播，成为大家了解这个领域的入门之参考。十几年过去了，当下的主题是"精准医疗"，而中国市场流传着免疫分析将被管式化学发光系统取代。受CAIVD之托，再次更新撰写酶免分析进展。本次，我把自己多年的研究与学习，富集知识、历史及业界动态一并综述，将主题细化，形成了本文题目，谨供有关人士针对精准医疗目标，利用微板技术发展高通量、高内涵、高分辨之大数据采集作为参考。

第一章  酶联免疫分析技术
(Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)

1952年美国威斯康星大学的理查德·高德伯格(Richard J. Goldberg)首次发表了正确描述抗原-抗体反应文章，形成了抗原-抗体反应的"高德伯格理论" 这是现代蛋白免疫理论与应用的基础^[1] 。

最早的基于抗原-抗体反应的免疫蛋白特异性检测技术，是建立于1960年的放射免疫分析技术（RIA）。美国纽约退伍军人管理局医院的所罗门·伯森(Solomon Berson) 和罗莎林·雅洛(Rosalyn Yalow，图1)最先发表了内源性血浆胰岛素的测定^[2]。为此，罗莎林·雅洛独占了1977年诺贝尔医学奖的一半，以表彰她建立肽类激素的放射免疫分析技术。虽然，伦敦米德塞科斯医院的罗治·伊金斯(Roger Ekins)博士也在1960年发表了他的发现，利用饱和分析(saturation analysis)检测血浆的甲状腺素^[3]，但并未有缘诺贝尔奖。

尽管免疫蛋白特异性检测技术的早期应用，采用了竞争性原理以便在均相反应体系(homogeneous reaction)下定性和定量测定未知物，但是为了洗涤移去、排除未结合的抗体或抗原来保证检测的特异性specificity、真实性fidelity，就必须将抗原或抗体固定到一个固体（如孔壁）上，这就是异相免疫分析逻辑的建立。瑞典乌普沙拉大学的Leif Wide和Jerker Porath在1966年发表了固相免疫技术(Solid-phase technique)原理^[4]，这是人类认知能力的进步。

自60年代起放射免疫分析技术迅速发展，就已经开始采用亚克力手工制作的微板。1965年由美国的Cooke Labs(现在更名为Dynex Technologies)上市了亚克力注塑工艺的96孔微量滴定检测板Microtiter，以高通量来平衡复杂费时的操作。直到70年代初期，大多数放射免疫试剂基本上是由研究人员自己"家酿"的，并需要在特殊的放射防护实验室里操作。后来，德国Boehringer-Mannheim (宝灵曼)公司, 美国Abbott (雅培)公司及荷兰Organon Teknika (欧伽侬)公司等成为最早的放射免疫试剂制造商，提供初步标准化、经济合算的RIA试剂盒。

放射免疫分析（RIA）在80年代末期达到高峰并开始衰落(发展趋势统计见图2)^[5]，是因为另外一项更简洁、更安全的技术出现和快速发展，这就是始现于70年代初期的酶联免疫技术(Enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA) 。

酶联免疫分析（ELISA），是用酶标记替代放射物标记，并利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应的一种免疫技术。由于ELISA可用于几乎所有的可溶性抗原抗体的检测、没有放射性污染，避免了潜在的人体伤害，并由于酶催化底物显色有很强的放大作用而无需昂贵的测试仪器，这使得基于微板的酶联免疫分析成为临床检验、药物开发和生命科学等实验室最基本的工具。1971年，瑞典斯德哥尔摩大学的彼得·皮尔曼(Peter Perlmann) 和伊娃·尹格瓦(Eva Engvall)，荷兰Organon Teknika (欧伽侬)公司实验室的安童·舒尔茨(Anton Schuurs) 和宝科·范维曼(Bauke van Weemen)，以及法国巴斯德研究所的Stratis Avrameas等人分别独立地发表了辣根过氧化物酶HRP标记的应用文章，建立了酶联免疫分析方法^[4]。

Organon Teknika (欧伽侬)公司最早在生殖内分泌领域商业化了血浆hCG、总雌激素、人胎盘催乳素等酶免试剂，这一时期产品在灵敏度方面还不能与RIA试剂媲美，所以尽管申请了美国专利US762120等知识产权，但直到80年代初期市场表现并不成功。

70年代初期在血液筛查开始的乙肝病毒检测，促进了ELISA技术及其相关设备的自动化的发展。在选择具有放射性危险的半自动RIA系统，或选择缓慢复杂的血球凝集滴度试验，或是操作明晰的ELISA技术，血液筛查市场选择了ELISA技术。

1976年Organon Teknika (欧伽侬)公司上市96孔微板的乙肝表面抗原ELISA试剂HEPANOSTIKA 得了高度成功，这是世界上第一个商业化的ELISA试剂盒（图3）。同年4月，德国临床化学学会(DGKC)向瑞典人皮尔曼和尹格瓦，荷兰人舒尔茨和范维曼四人颁发了德国科学大奖"Biochemische Analytik"(生化分析，图4)。当然遗憾的是，这个针对ELISA发明的颁奖，并没有影响到第2年的诺贝尔医学奖-RIA发明的评选。

导致ELISA试剂取代RIA试剂的真正推动力，是来自80年代初期单功能的自动化设备开发。这些设备包括，瑞士Hamilton(哈美顿)的Micromedics自动加样设备，芬兰LabSystems（雷勃）的多通道加样器, 酶标仪及洗板机，德国宝灵曼的全自动酶标系统。这些设备的自动化以及操作简便，使得许多内分泌激素测定和传染病检测由特别污染/废弃物管制的放射同位素科，可以转入到普通的实验室进行。此外，瑞典人皮尔曼和尹格瓦没有将ELISA申请专利，而Organon Teknika (欧伽侬)公司后来虽然申请了，却没有独霸，而是专利许可了超过100家公司，这也是普及ELISA的发展动力之一^[6]。

从此，ELISA作为一种非放射标记的免疫分析技术开始在世界各地实验室成为常规的检测手段，不但为人类健康和疾病临床诊断、治疗监控提供特异性的数据，而且也触发了体外诊断(IVD)工业的形成。在2012年，商业化免疫分析市场已经达到了170亿美元的规模（见图5）^[6]。许多临床化学家也发展成为临床免疫学家，酶联免疫分析技术是一项伟大的发明。

图5 2012年免疫分析市场规模与分化^[6]

中国的免疫分析诊断工业起步于70年代初期。时任北京医科大学人民医院检验科主任的陶其敏教授（见图6），在1973年10月自行研制出中国第一套乙肝检测血凝法试剂盒，开启中国病毒抗原-抗体免疫检测时代。成立于1985年的北京北方生物技术研究所或许是中国最早的放免试剂生产商。1990年中国医学科学院基础所内分泌室陈克铨教授最早开发了96孔微板的hCG检测的ELISA试剂盒，用于早孕检查。1988年10月10日，解放军军事医学科学院基础医学研究所正式创建"北京四环生物工程制品厂"，并于1991年独家获得乙肝五项ELISA试剂的生产文号和新药证书，这是中国最早的用于传染病检测的ELISA试剂。

表1是2011-2015年五年间中国食品药品检定研究院对用于血液筛查的四项ELISA试剂盒进行批批检的数据表，仅这四项血液筛查的试剂，每年的年测试总量达5亿次，这意味着每年大约有5亿以上的人次，至少每人做一项检测。这个数字并不包括，采用发光免疫检测的临床市场（特别是进口产品），临床检测的总量应该不少于血液筛查的检测量。

表1 2011-2015年中国食品药品检定研究院对用于血液筛查的四项EIA试剂盒进行批批检的数据

人份	2011	2012	2013	2014	2015
HBsAg 检测总量	193,865,400	177,504,112	175,693,824	201,973,568	179,364,336
其中进口试剂总量	5,054,208	5,451,264	5,875,200	6,181,920	1,973,280
anti-HCV检测总量	113,947,648	111,195,456	111,196,976	125,726,208	125,126,592
其中进口试剂检测总量	5,876,640	5,421,600	5,849,200	5,861,280	4,167,840
anti-HIV检测总量	126,978,278	129,097,152	135,855,744	132,163,680	147,749,088
其中进口试剂检测总量	4,634,112	8,077,920	7,911,840	11,561,280	11,722,560
Syphilis检测总量	81,232,512	85,133,088	87,528,000	90,047,328	103,279,200
其中进口试剂检测总量	125,760	802,560	715,680	624,960	148,800
四项检测总量	516,023,838	502,929,808	510,274,544	549,910,784	555,519,216
其中进口试剂检测总量	15,690,720	19,753,344	20,351,920	24,229,440	18,012,480

毫无疑问，以上数据表明，中国是世界上最大的ELISA试剂生产国和消费国。

50余年来，基于96孔微板的ELISA技术已经成为各种实验室最基本的检测手段，蛋白免疫特异性分析为基本的临床诊断、治疗检测以及药物研发，提供了大量数据。

过去的50余年来，人们不断地试图对基于微板的ELISA技术的各个环节，进行创新、改进，以便将这项伟大发明的应用，提升到更新更高的水平。例如，在自动化平台上，新的或替代的ELISA形式正朝向微量化(miniaturized)或微流体(microfluidic)组件发展；微板的包被正在实现全自动化，以提高试剂的精密度；试剂盒组份正在"聪明化"(cartridge-based reagents)，以减少试剂试验的准备时间等等。在试验操作上，改进洗板自动化提高洗涤效率，以适应第4代高包被(high binding)的高灵敏度需要；采用发光底物来改进传统比色在高浓度(OD值大于2.0)检测的低分辨率，拓宽定量动态的线性范围；在固相载体上，使用磁珠或微粒，以减少包被蛋白与检测蛋白扩散(diffusion)距离，缩短了抗原-抗体结合平衡时间，还增加了多蛋白包被组合的可能性。

无论如何，微板作为N x 96个微试管处理单元，其设计本质就是批量、整体处理这些微试管，以便在复杂的试验过程中提高总体效率，这就是人们在不停地发展这项技术的原因。

毫无疑问，在精准医疗概念下，我们需要更细致、更大量的蛋白数据作为诊断信息，以支持精准治疗，因此，具有高通量(High-throughput screening，HTS)、高内涵(High-content screening，HCS)、高分辨(High-resolution screening，HRS)特征的基于微板的ELISA技术，将在蛋白和核酸分析方面出现新的发展。

下面，我们将分别以微板及酶免自动化的过去、现在进行全面综述，以展望未来的ELESA前景。

第二章  微板
（Microplate）

1.微板发展进程
作为检测分析器皿，微板最早是由匈牙利医生、科学家和发明家 Gyula Takátsy于1951年手工制造而成。当时匈牙利流感疫情严重，需要找到了一种快速、经济和可靠的测试方法来鉴别流感病毒。采用当时的标准测试方法，需要很多试管进行系列稀释，过程繁琐，成本高并费时，且结果并不太可靠。Takátsy采用管挨着管、线性回路式进行布局，就可以对多个试管同时加入等量标本，大大地提高实验标本的处理通量，这就是8×12孔的96孔微板的由来。

最初商业化96孔微板是用亚克力注塑的，主要应用还局限在血凝抑制试验，由于便于系列稀释操作，使得微板在病毒和血清滴度测试中发挥主流作用。直到开始使用聚苯乙烯polystyrene注塑的微板作为蛋白吸附固相载体，才使得96孔微板在RIA和ELISA中成为核心作用。

图7 微板的商业化进程

经过50余年的开发，2:3矩阵形状的微板已经千姿百态、形式各异，以适应高通量的应用。从反应孔密度来分，已有6孔、24孔、96孔、384孔 (诞生于1992年)以及1536孔微板(诞生于1996年)，甚至3456孔微板(诞生于1996年)和9600孔微板(诞生于1997年)也在开发中。但受表面张力的影响，高密度384孔和1536孔微板，在加样、洗板等处理成为瓶颈，至今没有商品化试剂盒供应；而受液体蒸发的影响，超高密度的3456孔和9600孔微板的应用更加困难。但是，强大的高通量、高内涵的大数据需求，迫使人们持续追求高密度孔微板的处理解决方案（图7）。

此外，根据分析测试需要，微板在除了光学透射传统格式外，其他方面处理也在变化中。如，为了避免密集的孔间所产生的串扰(cross-talk)，采用荧光测试时就选择黑色板材；采用发光测试时就选择白色板材；当采用顶部荧光测试时，选择孔底实心不透的；而采用底部荧光测试时就需要孔底透明的。为了吸附蛋白、核酸，就选择聚苯乙烯材质并做表面处理增强结合量；为了避免吸附蛋白和核酸的长期存储，就采用聚丙烯、COP等疏水、保湿强的塑胶。表面涂层也是微板处理的经典手段，目的是降低非特异性结合，增强细胞组织培养固着等等。

在微板的发展史上，重要发明事件在下面编年表2中，由此可鉴，这是多么不一般的塑料板！

表2 微板重要发明事件编年表

年代	创新者	隶属机构	主要贡献
1951	Dr. G. Takatsy	N.I.P.H. Hungary	机加工的72/100孔亚克力微板
1952	Dr. G. Takatsy	N.P.H. Hungary	首款机加工的96孔V形底孔亚克力微板
1953	Mr. John Liner	Linbro Company	首款真空成型的96孔微板
1963/1964	Drs. Sever & Cooke	N.I.H. Labs USA	首款模塑的96孔微板
1965	Cooke	Cooke Labs USA	设立公司，使用亚克力及后来的聚丙乙烯制造96孔微板
1966	Dr. Knebel	Griener Labs	在欧洲首次生产96孔板
1968	Cooke	Cooke Labs USA	微板Microtiter专利发布以及商标注册
1968/1969	未知	Falcon (now BD)	6孔PVC加热成型板诞生
1968/1969	N.A.	Dynatech Labs	Dynatech公司收购美国库克Cook Labs公司
1969/1970	Dr. Morningstar	Data Packaging Corp.	定制Microtiter酶标板塑模
1970	N.A.	Dynatech Labs / Data Packaging Corp.	成立著名的CoStar合资公司
1971	Cooke	N.A.	起诉John Liner，导致微板专利宣告无效
1972	N.A.	Dynatech Labs / Data Packaging Corp.	二家的合资公司解散
1972	Dr. P. Cleveland	Univeristy of Minnesota	首次出现具有过滤管腔的微板
1974	Allister Voller & Ken Walls	London and CDC	ELISA试验上开始使用微板
1975	Greg Mathus & team	CoStar division of DPC	微板格式重新设计
1975	Griener Labs	Griener Labs	平底和U型底的8孔条微板
1976	未知	Falcon (now DB)	开始塑模生产96孔微板
1976/1980	N.A.	Corning, Nunc	Corning公司和Nunc公司进入96孔微板市场
1979	A. Thorne	Dynatech (Dynex)	可组合的单板条和板架Removawell™微板
1980	Dr. P. Cleveland	V & P Scientific	首款具有玻璃纤维滤芯GF discs的微板
1980	Dr. P. Cleveland	V & P Scientific/ Schleicher & Schull	首款96孔斑点印迹腔微板
1981	Kivosky et al	Millipore	机制96孔滤芯微板
1981	Dr. Cleveland	UCLA at San Diego	首款96孔滤芯微板专利
1982	A. Thorne	Dynatech (Dynex)	首款有色（黑和白）微板
1983	A. Thorne	Dynatech (Dynex)	在欧洲发表了有颜色微板专利
1983	Dr. M. Jolly	Pandex (now Iddex)	首款96孔滤芯底黑色微板
1984	Roy Manns	Meipec	设计首款无串扰信号的滤芯微板
1984	Roy Manns et al	Genemed Engineering	首个双件组合的滤芯微板专利
1985	Roy Manns et al	Genemed Engineering	生产硝化纤维素滤芯微板
1985	Dr. P. Cleveland	V & P Scientific	首款有12孔滤芯板条的96孔微板
1986	Roy Manns	Genemed Engineering	接手微板开发
1987	Dynatech研发团队	Dynatech Labs	带有8孔和12孔板条的96孔微板
1987	Manns, Saunders et al	Polyfiltronics Ltd.	在英国的新公司负责滤芯微板
1987/1988	Dr. V. Matkovich	Pall Corp.	开发3层 96孔微板
1988	CoSar研发团队	CoStar	引进8孔滤芯微板条
1988	Barry Bochner	Biolog	首个邮票大小的微板
1990	Roy Manns et al	Polyfiltronics / Packard	首款96孔透明底微板
1990	Tom Astle	TomTech / Pfizer	带有Porex滤柱筛的24孔微板
1991	未知	Helix	首款864孔微板
1991	Richard Goodwin	Neuroprobe	首款具有细胞趋化分析腔的96孔微板
1991	Roy Manns	Polyfiltronics	首款玻璃纤维材料的微板
1992	Dr. G. Lennon et al	Lawrence Livermore	开发首款384孔微板
1992	Dr. Bochner et al	Biolog / Polyfiltronics	首款具有35mm玻片形式的48孔细胞培养微板
1992	Genetix研发团队	Genetix	第一款商业化384孔微板
1992	Roy Manns et al	Packard Instruments	96和24闪烁计数滤微板
1992	Richard Goodwin	Nueroprobe	具有可视滤膜的趋化分析腔微板
1992	Roy Manns et al	Pakard Instruments	底部发光分析96孔微板
1993	Millipore研发团队	Millipore	MultiScreen96孔PVDF滤膜微板
1994	Richard Goodwin	Nueroprobe	首款25ul低孔板和滤框ChemoTX系统
1995	Roy Manns/Dr. Seed	Polyfiltronics / AGTC	首款DNA深孔滤芯微板
1994	Roy Manns et al	Polyfiltronics	首款注模PCR微板
1995	Manns / Margolin et al	Polyfiltronics	首款注模384孔PCR微板
1996	Manns / Young et al	Whatman	首款1536孔微板
1995/1996	Manns et al	Polyfiltronics / MDC	首款96孔紫外透过微板
1996	Manns et al	Whatman / Aurora	首款3456孔纳米微板
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款注模1536孔微板
1997	Richard Goodwin	Nueroprobe	300ul ChemoTX系统
1997	Manns et al	Evotec / Whatman	首款96孔玻璃底微板
1997	Dr. K. Oldenburg	Du Pont	首款9600孔微板
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款方孔1536孔微板
1997	Genetix 研发团队	Genetix Ltd	首款圆孔1536孔微板
1997	Lipsky, Manns	Whatman	首次2mm 玻璃/PP-组合化学
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款透明底1536孔微板
1997	Dr. Knebel	Greiner Labs	首款小体积（20ul）96孔微板
1998	Polyteam	Whatman Group	首款深孔（400ul）384孔微板
1998	Dr. Knebel	Greiner labs	紫外透过384孔微板
1998	Dr. Smith et al	Whatman	装载树脂的生物分析板
1998	内部研发团队	Affymax / Whatman	首款864方孔微板
1998	内部研发团队	Affymax / Packard/ Whatman	首款864孔可视滤膜微板
1999	内部研发团队	CoStar	96孔滤芯微板
1999	内部研发团队	Millipore	一体化96孔滤芯微板
1999	内部研发团队	Whatman / Polyfiltronics	首款48孔5ml矩形微板

2.微板的SBS标准化
毫无疑问，微板作为一种开放的分析器皿，应用在实验的各个处理过程，如加样、混合、孵育、离心、洗板以及读数，标准化是统领各种处理的核心。感谢生物分子筛查学会(Society for Biomolecular Screening, SBS)于1996年在瑞士巴塞尔发布了微板的标准定义，1999年完整定义了微板全部几何尺寸。2003年提交给美国国家标准化组织（ANSI），ANSI于2004年颁布了包括96孔、384孔及1536孔微板标准(ANSI/SLAS 1-2004 至 ANSI/SLAS 4-2004)。微板标准（SBS）的制定，极大的促进微板以及相应的外围部件和设备的通用性和开放性的进一步开发，以便人们更好的利用微板开发ELISA试剂。

3.反应体系微量化
在过去的很长时间里，96孔微板在ELISA、CLIA、NAAT领域中被广泛使用。由于96孔微板有限的孔数量，迫使试剂研发者将多种蛋白组合在一个孔中，这样导致其灵敏度和特异性的下降且不能把多种蛋白真实性完全表现出来，这已成为公认的事实。近年来，人们正在384孔和1536孔微板上寻求大的突破。

由表3可见，高密度孔微板随着孔密度的增加，除了因微量化(miniaturization)可以更多减少试剂使用量而减少试剂的成本外（见表4），还可以大大缩短孵育时间以提高效率。高密度孔微板分析微量化有着诱人的前景(见表5)。越来越多的研究发现，高密度孔微板分析（如384或1536孔微板）的微量化，不仅能够获取同目前常用的96孔微板分析一样的精密性，并且能够明显提高分析的灵敏度^[16][17][18]。

表3 三种不同微板在正常气压蒸发条件下工作时，其固相反应性能的比较

	1536孔-微板	384孔-微板	96孔-微板
典型反应体积	6.00 ul	25.00 ul	100.00 ul
反应表面积	17.79 mm²	41.76 mm2	94.00 mm2
抗原-抗体复合物浓度[Ag-Ab]	4.71 keq[Ag][Ab]	2.65 keq[Ag][Ab]	1.00 keq[Ag][Ab]
扩散距离（X）	0.80mm	1.70mm	3.50mm
扩散时间（X2= Ddif•t）	0.66/Ddif	2.89/Ddif	12.25/Ddif
孵育时间	4.00min	14.00min	60.00min

表4：基于96-孔微板ELISA试剂盒 VS. 基于384-孔微板ELISA试剂盒成本分析

所需成分	单价	成本/ 4 X 96孔-微板	成本/384孔-微板
		反应体系 100ul	反应体系 50ul
微板	€0.97/96孔-微板 € 2.44/384孔-微板	€ 3.38	€ 2.44
捕获抗体	€330.00/ 500 µg	€ 50.68	€ 25.34
封闭蛋白	€345.00/50 µg	€ 0.48	€ 0.24
检测抗体	€425.00/50 µg	€ 97.92	€ 48.96
封闭血清	€49.00/25 ml	€ 1.52	€ 0.76
SA-HRP	€250.00 per 1 ml	€ 48.00	€ 24.00
TMB底物	€49.00 per 100 ml	€ 18.80	€ 9.40
封板膜	€49.00 per 100 pieces	€ 1.96	€ 0.98
终止液	€13.55 per 1L	€ 0.76	€ 0.38
合计		€ 223.50	€ 112.50

表5 微板分析微量化的优势

优势	结果
减少反应体系	减少了昂贵试剂、生物样本和一次性耗材的用量 更少的产生生物和化学有害废弃物
提高分析性能	显著提高检测标的物的分析灵敏度
快速试验过程	在384孔或1536孔微板的孔中有更快的扩散速度 明显减少每个孵育步骤的孵育时间
高通量处理	384-孔微板 或 1536-孔微板反应模式是96孔微板的4或16倍 提高实验室处理的效率不仅仅是4或16倍

 

根据HTStec公司2012年调查报告（见图8），有57%的用户认为96孔微板分析可以满足需要，但另有43%的用户需要更微量化分析试剂，寻求384孔或1536孔等微量格式板。除了微板外，人们还试图采用微流体microfluidic来实现微量化。

图8  HTStec公司2012年关于ELISA试剂盒微量化需求的调查报告

4.微板包被系统：
在国内体外诊断试剂不断发展的二十多年间，人们也从早期仅关注试剂产业的变化、技术的进步、政策法规等，逐步发展到对试剂生产的质量控制的重视。包被了特异性蛋白的微板作为ELISA试剂中的特异性捕获固相载体，可靠的微板分析的第一步也是关键的一步是正确的将蛋白（抗原或者抗体）包被到微板上。微板包被，主要处理包括：包被-孵育-洗涤-封闭-干燥（见图9）。作为影响ELISA试剂质量关键之一的微板包被系统，也逐渐引起了行业内的关注。

图9微板包被流程

2005年，北京拓普公司推出第一台国产微板包被机，其采用96针加液头，但加液精度CV值仅为3%～4%，功能也仅仅是能够完成微板的包被液处理。2009年，该公司在国内市场推出第二代W369大型洗板封闭一体化包被机，将洗板封闭两工序合并，适用于大批量生产过程中的自动加液、自动洗板、自动封闭处理。到2012年，又成功推出了第三代微板包被机，增加了自动装载与自动存放微板的功能，孔间加液CV值不超过2%。这类型的国产包被系统，仅仅能够自动处理微板的"包被"、"洗涤"和"封闭"，并没有集成在线的孵育和干燥模块，从这个意义上讲这种自动包被机的应用仍处于"半自动"的微板包被模式。

目前，大部分ELISA试剂生产商都是采用半自动化的模式（有的甚至采用基于洗板机注液模式）进行微板的包被生产（见图10），由于采用分液精确度不高的洗板机或液体工作站及这种批量化的处理模式，容易存在人为的误差，导致包被的微板"孔-孔"、"板-板"、"批-批"之间存在明显的差异，影响了蛋白特异性检测的分析性能。采用这种"半自动化或手工"模式包被的微板ELISA试剂，其CV%变化非常大。目前很多国产的血筛试剂的"批一批"CV%在10-15%[^14]，有的甚至CV> 15%^[10]，这与采用的微板包被模式有一定的关系。

良好的制造规范(Good Manufacturing Practice, GMP)是ELISA试剂质量保证的基础，得益于自动化技术的发展以及新的液体工作站不断提高加样精度，市场上逐渐出现了集成的自动化包被系统。主要有德国OPTIMA的ImmuCoatR生产线（图11）等。这些自动化的微板包被系统，集成了高精度加样的液体工作站（或分配/吸液模块）、多通道洗板模块、孵育模块、喷码模块、微板传递模块等，实现了微板包被的自动化，消除了人为的误差。采用这种"批量自动化微板包被系统"包被的微板ELISA试剂，能够非常好的将"孔-孔"CV值控制在5%, "板-板"、"批-批"的CV值控制在在5-10%。

随着新技术的不断发展，以蛋白的特异性检测为ELISA试剂已经发展到超灵敏度和超特异性的新世代。而其中材料改性技术和表面修饰技术等相关技术的发展，为ELISA试剂提供了高绑定蛋白能力的固相载体平台^{[8][11][12][13]}，以此为基础的ELISA分析，其检测限甚至达到了pg级的水平^[9]。这就对微板包被系统提出了新的挑战-更低的"孔-孔"、"板-板"、"批-批"的CV值。这就要求微板包被系统除提高加样的精度及消除人为误差外，还需改变"多板"处理的"批量"生产模式至"单板"处理的"连续"生产模式。烟台澳斯邦AusCoating Line是世界上第一条把生产模式改"批量"为"连续"的全自动微板包被生产线，从而实现了每块微板包被全过程完全一致（图12）。除此之外，AusCoating Line通过识别每块微板唯一的条码实现了从上载到包被全处理过程的追踪记录，确保了完整的溯源"证据链"，是目前唯一的满足良好生产规范（Good Automated Manufacturing Practice，GAMP）的完全全自动化的微板包被系统。结合独有的"封闭式环境控制系统"，实现了生产过程中最大化的一致性和可重复性、极致的孔间加液精密度达到CV<1%（50-1000ul）。

表6 目前已有的自动化包被生产线对比

	AusCoating Line	ImmuCoatR Production Line	M10-D1+2
处理模式	单个处理	单个处理+批次处理	单个处理+批次处理
	每块板完全一致的处理步骤	每块板不是完全一致的处理	每块板不是完全一致的处理
液体处理	96头	8 /96针	8/16/96针
	一次性加样尖	管路系统	管路系统
	不同的包被批次, 只需更换加样尖	不同的包被批次, 需彻底的清洗管路	不同的包被批次, 需彻底的清洗管路
微板传递	Rack Runner轨道	传送带	传送带
洗板单元	AusWasher 无接触洗板	96 头洗板机	96 头洗板机
	无洗板机堵针的现象 不同批次间，无需清洗管路 更适合自动化生产	接触性洗板 不同批次需清洗管路以避免交叉污染	接触性洗板 不同批次需清洗管路以避免交叉污染
孵育单元	在线的孵育架	在线的孵育器	在线的孵育器
	单个板处理	批次处理	批次处理
	每块板孵育时间和条件一致	每块板不是完全一致孵育时间	每块板不是完全一致孵育时间
	带盖孵育	无盖孵育	无盖孵育
干燥	AusDryer	风导干燥箱	传统干燥箱
	将蛋白损伤降到最低	更高的蛋白损伤	更高的蛋白损伤

第三章 微板设备
（Microplate Automation）    

随着ELISA试剂的市场迅速发展，人们对处理微板的相关设备的自动化、精密度和高通量等的要求也越来越高。在ELISA实验中对实验过程、实验结果有影响的设备主要是涉及加样、加试剂、洗板、孵育、读数等相关部分，下面一一论述。

1.加样设备
根据美国病理家协会（CAP）的调查报告，在实验室误差（ERROR）产生的原因中，有79%的因素是因为实验过程中样本处理不当造成的。区别于其他临床检验技术针对每一反应单元对应一份标本，酶免试验的样本处理和试剂的分配，必须基于96孔微板的批量化操作。为保障整板内各孔标本孵育时间的最小差异，必须采用8通道或12通道快速加样，以致于96通道。

首先是Dynatech公司推出的Dynadrop SR，配有八个分液通道的手动注射分液装置，可以进行25或50 ul试剂的分配（图13）。

后期又推出The 96-Channel Autopipetter，是配有96通道的专为微板设计的半自动的分液器，可以同时吸取并分配96份25或50 ul的试剂至微板中（图14）。

  

Dynatech公司的Dynadrop MR可以通过12个分配头连续分配相同或不同的试剂（图15）。

Titertek Autodrop是一台由微电脑控制的分配器，能够自动控制配液量并自动推进微板孔，分配体积10-300 ul可选（图16），于1981年在FDA登记注册。

Dynatech公司的Rotatiter手持微板移液器可配置多达12个郁金香花型循环分配器进行系列稀释。把此装置连续的放到连续的板孔中，由电动马达驱动进行连续稀释，分配体积为25和50 ul（图17）。

Dynatech公司生产的The auto III with SRD III，可以通过预先编程，在不同规格的微板可实现自动稀释器、分配器、吸液器上述三种功能。可以进行系列稀释，并可在微板孔中吸/注预定体积的试剂（图18）。 

另一款自动稀释分配器是为更大容量的试管设计的，由微电脑控制，能够实现单个或系列稀释（FP-801采样器，芬兰赫尔辛基Labsystems Oy公司，图19）

实验过程中，经常会遇到同一样本需要做多个检测项目，需要重复吸取样本，这就需要有传输装置可以从共同来源处吸取等量样本。为此，人们开始使用半自动96通道移液器进行转移，例如从共同来源补充或稀释红细胞，或从一块微板到另一块微板进行多个样本稀释。一个新的平行转移装置可以用于同时在微板间转移96个25或50 ul样本（如图20所示）。

随着酶免试验的普及，加样设备的发展也经历从手动操作到自动化的过程，加样的精密度随之越来越高，更好的保障实验的准确性。从基于管路稀释分配器原理的样本处理机得到快速发展，先后有数家厂商开发了十余种样本处理机，以满足实验室液体处理需要。这其中又以瑞士Hamilton公司的产品为典型代表。

1947年，哈美顿股份公司（简称Hamilton公司）的创始者克拉克·哈美顿来到位于加州大学伯克利分校的放射实验室，师从于劳伦斯博士（1939年诺贝尔物理学奖得主，劳伦斯伯克利国家实验室）。在那里，他研究开发处理放射性物质的工具和设备，甚至包括手套箱。在此期间他发明了世界上第一支微量进样针，该款经典的进样针在60多年以后仍畅销于全世界各大分析实验室用于色谱法实验。1970年Hamilton公司推出了第一款半自动稀释器。1974年Hamilton公司开始研发自动化机器人，很快便在1980年成功创造出世界上第一台全自动液体处理工作站用于样本的制备。1994年，该公司Micrlab AT plus 酶标板样本处理机，具有全面的标本质量监测系统、加样质量保障系统和全过程控制（Total Process Control）系统，获得美国FDA许可，用于血液筛查实验室的产品。在中国自1996年开始引进AT样本处理机（图21），迄今为止已有200余台。2001年瑞士哈美顿推出Microlab STAR（图22）液体处理工作站，首次采用气体置换技术。

2.洗板机
ELISA分析试验中，洗涤是一个至关重要的异相处理步骤，通常人们称这一步骤为"洗板"，完成这一步骤的设备称之为"洗板机"。其本质是通过连续多次的洗液置换，以稀释和移除未反应的试剂和非特异性的杂质，降低背景值从而使分析获得更高的信噪比。洗涤不充分将会产生高的背景值，而过度的洗涤有可能会洗脱掉反应孔中的抗原-抗体复合物从而降低分析灵敏度。故从二十世纪七十年代引入了ELISA技术之后，科学家们不断地优化洗板方案、改善洗板质量，以求提高ELISA实验的敏感性和特异性。洗板方案演变至今，经历了以下几个阶段：手工洗板、简易洗板机、自动洗板机、集成全自动洗板机。

手工洗板通常是采用人工操作的方式，在每个孵育步骤后将微板孔内的反应液吸出或甩出，然后翻转微板，在吸水纸上轻拍以除去多余的残液，再注满洗液，放至两到三分钟后再将其吸出或甩干，再翻转微板在吸水纸上轻拍，根据要求循环3-5次。手工洗板残留量较低（拍干模式，残留量为0.5-1ul/well），能够有效的稀释和移除未反应的试剂和非特异性的杂质，但因其效率低，不能满足高通量的检测要求，并且由于操作人员熟练程度与操作手法的差异使得洗板步骤重复性差，从而影响检测结果。随着实验通量的增加、精度要求的提高，早期的一些公司推出了一系列仍需手工操作的简易液体分配器或洗板机以替代一部分手工操作。 如上世纪70年代中期，美国的M.A. Bioproducts公司推出的手动操作的"ELISA Wash Dispenser"能够实现大体积洗液的定量分配，明显提高了手工洗板分配洗液的效率（图23）。

进入八十年代，美国Dynatech Laboratories公司生产的"Miniwash Washer-Aspirator"手动洗板机，采用手柄推动进板，拇指控制活塞来分液；Miniwash具有独立的吸液头，采用真空方式将反应液从微板孔中吸除，以替代手工拍板，并使完成一块微板的洗涤时间缩短到了几分钟（图24）。Miniwash另外还配置了一排8针的注液头，但由于需手工操作，分液时很容易溢出而导致孔间"串孔"。后来，Dynatech Laboratories公司对Miniwash进行改进，推出了半自动化的第二代洗板机Dynawasher II（图25）。Dynawasher II采用各自独立的8排12针的注液头和吸液头，放置在水平轨道左右两边的位置，分别实现注液和吸液，能够同时处理96孔微板的所有孔。同Miniwash相比，Dynawasher II能够自动控制分液的体积，解决了洗液溢出的问题。

几乎同一时期，Flow Laboratories公司将第一台全自动的洗板机Titertek ® Multiwash推向了市场（图26）。Multiwash配置了2排8针的洗板头模块，提供了三种不同的洗板程序，可通过简单的编程控制注液和吸液，克服了手动或半自动洗板机可能发生的注液不均和吸液不彻底的问题，这种全自动化的处理模式使洗板时间进一步减少到1分钟。1984年Bio-Tek公司推出其第一台全自动洗板机EL402（图27）。该洗板机速度更快，处理96孔微板的1个吸/注液的循环仅需要8秒，彻底洗涤一块微板的时间仅仅需要25秒，孔间的分液精确度也大有提高。除此之外，EL402也增加了一些提高洗板效率的功能，如：可供用户选择的浸泡时间，洗涤循环次数等。（Dual chamber microplate washer；United States Patent 4493896 ）

 全自动洗板机问世30多年来，微板的应用也在不断地延伸，互相促进。如1992年诞生了第一块用于细胞培养的微板。在这30多年中，免疫分析技术也在不断地发展，如生物素-亲和素信号方法系统的应用、发光底物替代颜色底物、磁珠替代微板作为固相载体等。时至今日，洗板机已经不再是单纯的替代手工操作，也不仅是为了迎合高通量的需求。这一阶段为了提供良好的洗板环境，洗板机的发展强调得更多的是洗涤效果，而非自动化，洗板环境可以理解为利于改进洗涤效果参数及洗涤动作，全自动洗板机逐渐融合了冲洗压力、冲洗距离、冲洗时间、震荡、涡流、底部冲洗、两点吸液、交叉吸液和连续式冲洗等动作；并增加了更多兼容性，如384孔微板、深孔板、条板、磁板、滤板等不同用途不同规格的微板。

Bio-Tek公司得益于自动化和微电脑技术的发展，开发的第四代洗板机ELx405TM（图28），以其卓越的性能和优异的稳定性，成为集成全自动洗板机的代表。不但可以满足用户不同应用方向和检测通量的实验需求，还有更灵活的功能和更多型号可供选择。该时期的洗板机分液精确性、残留量等也得到了很大的提高，通过简单的面板操作，用户可以轻松编辑程序，完成既定洗板任务。

1992年，北京市海淀区天石医疗用品制作所（现北京天石天力医疗器械技术开发中心）研制出国内第一台全中文界面的自动洗板机ZMX系列。经过不断的技术改进，目前的ZMX-988B型全自动洗板机集成了多种洗板动作，在国内有较高的市场占有率。1993年起，北京拓普分析仪器有限公司起草了国内第一部洗板机行业标准，其公司上世纪90年代推出的微电脑控制的DEM-3型自动洗板机（图29），现在仍然出现在国内洗板机市场上。

回顾洗板机的发展历史，从简易型（基本手动式）到自动型再到集成全自动洗板机，通过不断改进吸液动作尤其是交叉式吸液动作，使液体残留量这个关系到液体置换稀释效率的关键指标不断接近手工洗板的水平。但受限于传统的负压抽吸式技术以及不同生产商技术水平，传统式洗板机洗液残留量仍有1-5ul。部分传统洗板机还集成了振荡功能来增强洗涤效果，但作用并不十分明显。而另一个问题，吸液管路容易堵针也是当前洗板机业内首要的难题。虽然Bio-Tek公司的洗板机集成了其专利的超声波清洗功能，便于堵针后的管路清洗，但是传统洗板机堵针的问题仍不能得到彻底的解决。

近几年，国内出现了采用水平注液方式与离心脱水技术的创新型洗板机，如深圳科软科技的KR系列（图30）、郑州基波公司的JB─Ⅰ全自动快速立式洗板机（图31）。

这种新型洗板机采用旋转离心和重力去液的方式彻底解决传统洗板机堵针的问题。但也有报道发现，这种基于水平式注液的离心洗板机的假阳性例数均多过传统洗板。这可能是因为传统洗板机洗板时微板平放在洗板槽内，针头逐行清洗，而立式洗板机则是整个微板竖立在洗板槽内，冲洗的阳性废液从上往下流经下方的阴性测试孔，从而增加了交叉污染的几率（见图32）。

烟台澳斯邦公司开发的AuswasherMTP系列洗板颠覆了负压吸液的洗板方式（图33），采用专利的离心洗板技术，免除了吸液针设计。不但彻底解决了微板孵育后出现纤维凝块阻塞吸液针的状况，其垂直的液体分注方式也解决了水平注液所导致的交叉污染问题（见图34）。AuswasherMTP每孔残留量达到小于0.01μl，效率比传统的MTP洗板机高出100倍以上。AuwasherMTP除可用于各种SBS标准的96孔微板外，同时兼容SBS标准的各种格式的384孔和1536孔微板，通过离心甩干克服了384孔和1536孔微板的传统洗板吸液困难，使单蛋白单孔反应实验达到终极诊断读出结果成为可能，并获得微量化和平行化的利益（图35）。

3.孵育器
ELASA试验中，在加完样本、检测蛋白等之后通常将在37℃条件下孵育。37℃的孵育条件是使酶免反应在接近人体体温的环境中进行，从而保持蛋白原有的活性的条件下提高蛋白的扩散速度，在一定时间内使蛋白（抗原-抗体进）间进行充分的反应从而达到动态平衡以形成稳定的抗原-抗体复合物^[19]。在众多影响ELISA检测结果的因素中, 孵育温度对反应体系的影响是最为关键的因素之一。因此，不但孵育温度和孵育时间对于ELISA试验是至关重要的，并且孵育温度和时间的标准化对于ELISA的检测结果也有直接的影响。孵育温度控制的不精确或不均匀，都会影响到ELISA试验的分析性能。所以，从ELISA方法建立之初人们就一直在不同领域开展对孵育方式的研究与改进。

采用水浴箱（图37）进行水浴孵育是最早应用于ELISA试验的，其也是传统的ELISA孵育方法。由于水浴箱没有定时装置，所以当有多个微板多次孵育时，对每块微板的孵育计时、分辨就会带来困难。大量的临床试验验证其是具有大热容量而可靠性的孵育方式，仍然是目前我国临床进行ELISA手工试验最常用的孵育方式。

为了更好的标准化孵育温度和时间，科研工作者开始探索和评估用于微生物和细胞培养的干式恒温孵育箱应用于ELISA试验的孵育，这种孵育方式通过加热到设定温度的空气作为导热介质对微板进行孵育称为"空气浴"。如奥地利的Labexim Products公司的TS (Thermostar) 孵育震荡器（图38）就是结合了恒温箱和震荡器的功能，缩小了体积用于微板的孵育，升温速度达9℃/分钟；其能够对孵育和震荡实现定时功能。基于干式恒温孵育箱的原理，采用微电脑控制和半导体制冷技术开发的干式恒温孵育器（图39），不同于干式恒温孵育箱完全依赖于空气导热，干式恒温孵育采用金属块(如高纯度铝材等)导热故其也可称为"金属浴"。这种"金属浴"的孵育方式，由于微板底部能够和导热金属块直接接触，使微板上每个孔的孵育温度比"空气浴"更均一。

 

除了上述提到的主流孵育发展之外，也有科研工作者研究了其他方式的孵育。上世纪90年代，很多学者发文报道用微波孵育的方法替代37℃水浴孵育，从而发现酶促反应时间比常规方法缩短近８倍，提示微波对大分子生物活性复合物有明显的生物学效应^[20]。微波孵育的原理是通过增加分子免疫复合物能量达到稳定扩散状态。

4.读数仪
读数仪的发展经历了由手动转为自动、从单孔读数发展为多孔读数的阶段，工作效率不断提高。最初，美国Brinkman公司生产的Organo微板读数仪，需要手持带有光纤的读数探头，逐一放置到每个孔中，光线反馈至光电管中显示为数字进行读数（图41）。美国Beckman公司的DU-8微板分析仪则需要与其DU-8 UV/VIS分光光度仪配合使用，使用单波长或者双波长对微板进行分析（图42）。

美国Gilford公司推出的封闭的自动化酶免系统，将整个酶免分析过程进行整合。该系统是将不同的TORCH抗原预包被在10孔试管条来完成抗体的检测。洗板是通过蠕动泵进行。读数仪是为10孔试管条专用设计的（图43）。

之后出现的美国Dynatech公司生产的MicroELISA Mini Reader MR 590（图44）及美国Bio-Tek公司的 ELISA Reader Model 307（图45）都是采用手动进板的方式，通过单个读数探头逐一对每个微孔进行读数。MicroELISA MiniReader MR 590主要适用于U底或平底微板。

为了提高读数及分析效率，读数仪逐步向自动化方向发展。美国Dynatech公司生产的MR 600读数仪实现了自动进板及定位，采用双波长检测微板的吸光度值。该设备可以在一分钟内读取一块96孔微板（图46）。芬兰EFLAB OY&美国Flow公司推出的Titertek Multiskan读数仪采用一次同时读取8孔信息的方式将读板时间缩短到一分钟（图47），与之类似的美国Litton Bionetics的 Bionetics Autoreader LBI-321同样可以单次同时读取8个孔（图48），但此读数仪可与Litton Bionetics公司的Bio-Enza-Bead系统配合使用检测TORCH抗原抗体及其他抗体，并引入磁转移装置中自动清洗微球颗粒技术。美国Artek Systems Corporation 公司生产的Artek Model 210 Reader通过预编程的方式，全自动进板定位，实现了45秒内完成读数（图49）。

1976年，设备生产厂商LabSystem (现在赛默飞世尔科技的一部分）将读数仪发展为Multiskan专用96孔光度计投入市场。这是目前常规读数仪的最早期版本，这一设备开启了我们现在所熟知的酶免读数仪时代。

随着免疫荧光技术的出现，荧光读数仪也随之出现。如早期的FIAX 100 Digital Fluorometer是一款微电脑控制的数字荧光读数仪，将扁棒上的样本插入中心孔中进行读数。数据输送进电脑中进行分析。此系统可与IDT生产的风疹病毒StiQ以及其他病毒抗体系统配合使用（图50）。

读标仪从40年前单一的吸光检测到几年前高度复杂的多模式的判读，现在的多功能读数仪已经发展到可进行紫外/可见吸光（UV/Vis Absorbance），发光（Luminescence）等，及其广泛的基于荧光的模式，包括荧光强度（Fluorescence Intensity，FI），荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET），时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence，TRF）及其TR-FRET、荧光偏振（fluorescence Polarization，FP）。德国的BMG LABTECH公司是这种多功能读数仪的代表，其在多功能读数仪发展史上创下了多个第一，如开发了第一台具有FP检测模式的多功能读数仪、第一个将激光技术应用到读数仪的比浊检测中、开发出第一台具有高性能化学发光检测能力的多功能读数仪、第一个将紫外/可见光吸收模式整合到多功能读数仪上等。CLARIOstar多功能读数仪（图51）是BMG公司推出的最新一代多功能读数仪。

随着纳米技术微量加样的发展，读数仪将很容易由检测传统的96孔微板，转化为检测384孔微板，甚至1536孔微板，达到更高的检测效率。另一方面，侧重酶免试验处理全过程技术——全自动酶免分析系统，到90年代末已充分发展；随着多任务软件，如OS/2，Unix及Windows NT等操作平台的完善，满足现代实验室GMP/GLP要求的全自动酶免分析系统，正在世界各种实验室普及。

第四章 全自动酶免分析仪的发展
（Developments in Microplate Automation）

1.自动化系统的发展
酶免实验室的自动化与标准化，是全面实验室自动化系统（LAS）的一部分。实现酶免试验自动化网络化，是涉及酶免加样（前处理）设备、酶免分析（后处理）设备与医学信息技术、实验室管理科学综合的高技术系统集成，是迈向全面实验室自动化（TLA）的重要基石。

实验室自动化系统是由样本处理与传递技术、开放式实验室仪器和开放式实验室信息系统（LIS）集成而至，并与实验室信息管理系统（LIS）联网。高分析生产力的酶免自动化分析系统，快速发报告意味着快速诊断、快速治疗，将给患者与医院带来双重利益。实验室自动化的目标就是提高检验的质量、增收节支。酶免实验室自动化网络化将给中国新医疗服务体制下的医院酶免实验室带来新的优势与利益。

全自动酶免分析系统在硬件和软件上均符合GMP/GLP规范，具备全过程控制（TPC）系统，可以全自动生成操作日志记录（Traceability）和系统追溯记录（Trackability），这些性能不但有助于建立信息化的质量控制（QC）和质量保障（QA）体系，而且在医疗纠纷举证中，这些记录证据还可以阐明实验操作正确性和可靠性，以及试剂厂商是否应承担试剂质量责任，便于纠纷的处理。所以对酶免自动化的需要不再一味地追求高通量、高速度，而是越来越重视酶免自动化设备在质量控制和全过程溯源等方面的性能。

酶免试验全过程自动化的意义，并非仅仅限于降低劳动强度、减少人为的误差。根据已发表的费米全自动酶标仪评价研究报告，人们发现：全自动酶免分析系统可以普遍地、显著地提高酶免试验的特异性。如费米系统可以提高乙肝表抗的特异性由常规设备的87%到91%，丙肝抗体由常规设备的89.1%提高到97.4%。此外，多中心的评价实验证明，费米全自动酶标仪也可以显著地提高国产试剂的灵敏度，如费米系统可以将乙肝表抗的灵敏度由常规设备的92%提高到93%，丙肝抗体的灵敏度由常规设备的93.7%提高到98.7%^[21][22][23]。

第一代全自动酶免分析系统基本特征是单/双针加样系统与微板处理系统一体化，多数孵育位置少于4块板。由于加样本将占用较长时间（单针每微板需15分钟，三块微板通常需45分钟完成加样本工作），因此，第一代全自动酶免分析系统，被认为是"节约劳动力而不提高效率"。

第二代全自动酶免分析系统的基本技术特征为单一任务和单一轨道。由于不能同时处理两种过程（如洗板的同时，不能加试剂等），因此其工作任务表（或时间管理器TMS）"堵车"现象仍无法避免，而造成处理过程不能严格执行，试验完成时间延长，或单纯执行试验时间表完成实验动作而不论试验效率。

第三代全自动酶免分析系统的基本特征是采用多任务、多通道，完全实现平行过程处理。典型产品为瑞士Hamilton公司的F.A.M.E.（费米）全自动酶标仪。费米系统独特品质表现在：硬件上采用了综合模块化设计，广泛采用液体水平检测（LLD）技术、体积与重量传感、光学位置传感等实现了真正全过程控制（TPC），特别是专利的洗板液体传感器，确保了最佳洗板效果，是保障试验特异性的关键。在软件与功能上，目前仍是唯一的全自动GMP/GLP规范符合系统，如全面的系统跟踪记录（Traceability）与系统追溯（Trackability），标本/试剂加样校验（Sample verification）及"自由任务管理"实现随时增加检测板。1997年费米获得美国FDA许可，用于血站筛查实验室，是第一个获得特许的全自动酶免分析系统，其不含样本加样装置，通常也俗称"后处理系统"。

表7 20世纪90年代主要全自动酶免分析系统特点（大/中型）

表8 20世纪90年代主要全自动酶免分析系统特点（中/小型）

1996年，烟台澳斯邦生物工程有限公司在河北省血液中心成功安装国内第一台费米全自动酶标仪，改写了当时的血液筛查试验技术，提高了血液检测质量，成为酶免实验室的主导设备，中国的安全输血事业由此进入新的里程碑。进入21世纪，以深圳市爱康电子有限公司（2013年更名为深圳市爱康生物科技有限公司）为代表的国内医疗器械公司相继成立，通过与德国、瑞士等国外合作厂商交流、研发生产微板分析自动化检验设备。2005年第一台国产全自动酶免仪URANUS AE诞生。

表9 目前国产酶免分析自动化仪器特点

2.微板及自动化系统未来趋势
早在2011年，美国医学界首次提出了"精准医学"的概念。直到2015年，美国总统奥巴马在其国情咨文中首次详细的提出了精准医疗计划（Precision Medicine Initiative， PMI），率先揭开了新医疗模式的面纱，使"精准医疗"迅速成为时下医疗行业最炙手可热的话题和出现频率最高的热词。奥巴马在报告中说 "要在正确的时间，给正确的人，正确的治疗。而且要次次如此。" 其本质就是通过基因组、蛋白质组等相关技术，对大样本人群与特定疾病类型进行生物标志物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确诊断出疾病的原因并确定治疗的靶点。在"精准医疗"模式下，目前的诊断技术需要对疾病不同的状态和过程进行精确的分类。而对于基于抗原-抗体（蛋白）相互作用的酶免技术，如果要在"精准医疗"中发挥关键作用，就应该如前边提到需要"更细致、更大量的蛋白数据"。故打破传统的"cocktails-ELISA"束缚，建立基于病原体生活史的"多矢量单蛋白谱分析"是酶免分析实现"大量蛋白数据"的发展趋势。"多矢量单蛋白谱分析"基于病原体的生活史先择多矢量（蛋白标志物）进行检测，以描绘出疾病的整个过程；该技术平台通过采用更高孔密度的微板（如384和1536孔-微板）和微量化实现了酶免分析技术的高通量、高分辨、高内涵。

"多矢量单蛋白谱分析"为酶免分析在"精准医疗"新医疗模式下的应用开启了非常明朗的前景，但这也为微板及其自动化的发展提出了新的挑战。1）目前市场上酶免自动化系统多是基于96孔-微板，导致针对除96孔-微板在液体处理及其洗板的自动化等方面实现的困难，是限制"多矢量单蛋白谱分析"发展实现实验室自动化的主要瓶颈。基于更高孔密度微板的自动化处理系统应该是酶免自动化未来发展的主要方向，加之目前全新的"绝对自动化"真正实现全实验室完整流程操作的无人工干预的自动化模式，也是提高酶免分析技术在新医疗模式下作用的重要前提；2）高通量、高内涵、高分辨的发展趋势，势必产生大数据。大数据对数据分析和管理提出了新的要求,目前自动化系统采集、传输、存储、分析等方面的能力将受到严重的挑战。云端大数据分析基于终端采集数据，在服务器通过无线互联网对检测样本的数据信息做可视化分析、预测性分析、数据质量监控和管理等以发掘出大数据价值。可以预见，未来"多矢量单蛋白谱分析"的数据通过与个体病史信息，体症指标的迅速组合，及自动分析，将提供给临床医师更全面的诊疗方案建议；3）线上到线下（O2O）互联网管理化，向用户提供远程服务：随着互联网商业模式的快速发展，通过3G/4G无线网络技术、无线定位技术、近场无线通信识别（Near Field Communication，NFC）等技术，酶免自动化设备可通过云服务器，实时掌握仪器运行状态、故障报警、试剂使用量监测、测试结果异常等信息，在第一时间对设备故障进行反应，实现远程维护、远程故障处理，提高售后维护效率，降低维护成本。

疾病诊断是"精准医疗"得以实现关键，基于"高通量、高内涵、高分辨"概念的新一代酶免分析技术和自动化平台将成为微板及其酶免分析技术自动化未来发展的方向， 同时也符合"精准医疗"的主流趋势。

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