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关键词：化学发光；吖啶；标记方法

化学发光分析法是分子发光光谱分析法中的一类,是指物质在进行化学反应时,由于吸收了反应时产生的化学能,而使反应产物分子激发至激发态,受激分子由激发态回到基态时,自身发出一定波长的光，故化学发光检测不需要其它光源,其背景噪音较小,检测灵敏度高,在对复杂体系如生物样品中低浓度的被测对象的分析中有极大的优势。

近年来多类化学发光物质被用于临床检验领域，随着对化学发光反应机理以及对化学发光试剂性能的影响因素的认识的深入,国内外研究者们设计并合成出了多种新的高光量子产率的化学发光试剂,它们的检测灵敏度不断提高,应用范围日益广泛。其中光量子产率较高的化学发光体系主要有以下几类: 1: 在免疫测定、寡核苷酸标记等方面得到广泛应用的吖啶衍生物类; 2: 具有结构简单、易于合成、水溶性好等优点而被在环境污染物、药物等分析等研究中广泛应用的鲁米诺衍生物; 3: 过氧草酸酯衍生物和 1,2-二氧杂环丁烷等[1]。本文参阅大量文献就光量子产率较高的吖啶类化学发光试剂的结构，化学发光反应特性及应用方面进行综述。

鲁米诺，异鲁米诺及其衍生物是最早被用作化学发光的化合物，但由于其应用于化学发光免疫分析时发光效率低，需要配合催化剂及增强剂,这导致该体系背景发光增强,使测量本底升高,从而限制了这一技术的灵敏度。1983年Weeks首次合成了用于化学发光免疫分析的吖啶酯AE-NHS，该吖啶酯可用于标记抗原,抗体,特殊蛋白,DNA等生物大分子,从而实现生物分子的化学发光分析。它以光量子产率高,背景低,与蛋白,抗原,抗体等偶合后,发光效率几乎不受影响,而成为优良的化学发光免疫分析标记试剂。广大研究工作者们在此基础上继而研究出多款,发光效率更高,热稳定性更好,水溶性更强的吖啶类化学发光衍生物。

  1：吖啶类化学发光物质分为两类,吖啶酯和吖啶磺酰胺。

1.1.吖啶酯类：（图一）

图一

1.2.吖啶磺酰胺类：（图二）

图二

2：吖啶类化学发光反应机理的研究已经比较成熟,其中主要经过三个步骤:（1）过氧化氢加成吖啶环的9位碳原子,（2）在碱性条件下生成过氧负离子,分子内进攻羰基,离去基团离去,生成不稳定中间体1,2-二氧杂环丁烷酮,(3) 1,2-二氧杂环丁烷酮开环生成吖啶酮,同时释放光子[2]。（图三）

图三

根据反应机理研究证明,当离去基团上R3,R4为给电子基团时（如R3,R4 =CH3）,能起到增大空间位阻的同时降低羰基亲电性,增加该化合物在水溶液中的水解稳定性的作用,从而保证了的光量子产率,信噪比高,这一点我司已经从合成DMAE-NHS,NSP-DMAE-NHS,NSP-DMAE-HEG-GLU-NHS和NSP-SA-NHS等吖啶类化学发光物质得到验证。当离去基团上R3,R4为强吸电子基团（如R3,R4 =F）,羰基亲电性增强,反应加快,发光速率加快,但与此同时自身水解稳定性降低过大,而至光量子产率低。当离去基团上R3,R4为弱吸电子基团（如R3,R4 =Br）,总体分子稳定性较好,光量子产率较高[3]。

3：吖啶NHS活化酯类化合物常用于标记抗体,蛋白等方法：(例如：NSP-SA-NHS)

3.1.主要试剂：

NSP-SA-NHS,深圳美凯特科技有限公司;Anti-TSH McAb;Sephadex G-50,GE Healthcare;标记缓冲液:0.1mol/L Na2CO3-NaHCO3,pH 10.1;纯化缓冲液:0.lmol/L PB,pH6.3,含0.9%NaCl；封闭缓冲液:0.05mol/L PB,pH7.4,含0.9%NaCI,l%BSA,0.04%NaN3。

3.2.实验方法：

将100ul 1mg/ml的Anti-TSH McAb置于在2ml a标记缓冲液中,称取一定量的NSP-AS-NHS,溶于无水DMF中,配成浓度为6.5mmol/L的NSP-AS-NHS溶液,滴加7.5ml 6.5mmol/L的NSP-AS-NHS溶液至a溶液中,室温下搅拌反应1h后,加入100ul 10g/L赖氨酸反应15min,使标记反应终止。标记物NSP-AS-NHS-Anti-TSHMcAb与游离NSP-AS-NHS通过Sephadex G-50柱(1x25cm)分离,用纯化缓冲液平衡并淋洗柱子,分离过程中用色谱仪监测蛋白峰,分别测量流出液的化学发光强度和280nm处吸光度值,取发光强度高且吸光度大的部分,加入1%BSA后分装冰冻保存。

4：吖啶类化学发光优势总结

相对于鲁米诺等传统化学发光物，吖啶类化学发光物质，检测操作简便，无需催化，也不需要增强剂,从而降低了背景发光,提高了信噪比,干扰作用少。另外通过修饰可改变其疏水性以适合各类蛋白,抗体等标记所需条件，且标记后不影响光子产率、发光强度大，标记物稳定。

参考文献

[1] Emil H. White, David F. Roswell, Andrea C. Dupont, Alan A. Wilson. Chemiluminescence involving acidic and ambident ion light emitters. The chemiluminescence of 9-acri-dinepercarboxylate anion. J. Am. Chem. Soc.1987,109 (17): 5189–5196

[2] Janusz Rak, Piotr Skurski, and Jerzy Blazejowski. Towar-d an Understanding of the Chemiluminescence Accompanyi-ng the Reaction of 9-Carboxy-10-methylacridinium Phenyl Ester with Hydrogen Peroxide. J. Org. Chem.1999,64 (9): 3002–3008

[3] Larry J. Kricka. Chemiluminescence and Bioluminescence. Anal. Chem.1995,67 (12): 499–502

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