结核病是由结核分枝杆菌复合群引发的一种慢性传染病，主要通过空气传播。肺结核的主要临床症状包括咳嗽、咳痰，可能伴有低热、盗汗、消瘦和虚弱等全身症状。除肺部外，结核病还可侵犯肝、肾、脑和淋巴结等其他器官，成为全球成年人死于传染病的主要原因。及时的诊断和治疗对控制疫情和提高治愈率至关重要。以下将简要介绍结核病的常见诊断方法。

1、微生物学检测

（1）抗酸染色涂片法：结核分枝杆菌的细胞壁中含有蜡质成分，对酸性染料具有抵抗性。经过特定染色后，结核分枝杆菌呈红色，背景则呈蓝色。

（2）结核分枝杆菌培养法：该方法准确性高，但培养周期长且对实验室条件要求较高，通常与其他检测方法结合使用。

2、免疫学检测

（1）结核菌素皮肤试验 （TST）：感染结核分枝杆菌后，免疫系统会产生特异性细胞免疫反应。将结核菌素（PDD）以小剂量皮内注射至个体前臂内侧，如果对结核菌素敏感，注射部位将出现红肿和硬结。

（2）γ干扰素释放试验（IGRA）：IGRA基于免疫系统对结核分枝杆菌特异性抗原的反应。当个体感染结核分枝杆菌时，体内的T细胞会产生干扰素-γ（IFN-γ）。IGRA通过测量这些T细胞在接触特定抗原后释放的IFN-γ来判断是否曾感染过结核分枝杆菌。

（3）结核杆菌 IgG 抗体检测：感染结核分枝杆菌后，免疫系统会产生特异性IgG抗体。通过检测血清中IgG抗体的水平，可以推测个体是否曾感染过结核分枝杆菌。

3、影像学检测

胸部X光：是影像学中最常用的初步筛查工具，能够显示肺部的异常表现，如肺结核的病灶、浸润、空洞等。

4、分子诊断技术

Xpert MTB/RIF：这是一种针对结核分枝杆菌（MTB）和利福平耐药性（RIF）的自动化分子检测方法，采用巢式实时聚合酶链反应（PCR）扩增MTB特异性序列rpoB基因，并通过分子信标检测利福平耐药决定区的突变。为进一步提高检测的敏感度，美国Cepheid公司推出了第二代系统——Xpert Ultra。

Truenat技术：Truenat技术是一项基于微量逆转录PCR和核酸杂交芯片相结合的结核病及耐药结核病分子检测技术，包括Truenat MTB、MTB Plus、MTB-RIF Dx 即时检测平台，是一种快速、便携且低成本的结核病及耐药结核病分子检测方法，适合在基础设施有限的地区使用。

线性探针技术(line probe assay，LPA): 该技术利用生物素化引物进行PCR扩增，扩增产物与固定于膜上的特异性寡核苷酸探针杂交，根据酶联免疫比色法进行结果解释。它不仅可用于MTB检测，还可用于药物耐药突变检测，应用平台包括GenoType MTBDRplus、GenoType MTBDRsl和Genoscholar NTM+MDRTB。

基因测序：二代测序（NGS）不仅能够快速识别结核分枝杆菌，还可以检测其对多种抗结核药物的耐药性。全基因组测序（WGS）能够提供详细的耐药机制分析和传播特征，设备成本高和技术要求复杂。

质谱技术：是一种通过‌电场和‌磁场将运动的离子按质荷比分离并进行检测的方法，可以用于非MTB和MTB的菌种鉴定，具有分辨率高、快速、准确、需要菌量少的优点。

等温扩增技术：该方法可以在恒定温度下扩增特定的核酸序列，能够在短时间内准确检测结核分枝杆菌及其耐药性，提升了结核病的早期诊断效率。

其他分子检测技术：关于结核杆菌基因及相关标志物的创新性检测技术层出不穷，这些技术在结核病的早期诊断和监测中展现出重要的应用潜力。以下是几种新兴技术，它们为结核病的快速检测提供了创新的解决方案：

美国佛罗里达中央大学Yulia V. Gerasimova团队利用分裂探针和视觉信号放大级联，实现了对耐药和药敏结核分枝杆菌（MTC）基因型的区分。脱氧核酶（dz）序列被分为两个片段，形成分裂的Dz（sDz）链。底物结合臂识别抑制PDz结构（IPDz）。在特定核酸靶标存在时，链S和链U与靶标杂交，形成Dz催化核心，裂解IPDz并释放PDz。PDz折叠成G-四链体，对血红蛋白具有亲和力。hemin-PDz全酶促进单电子转移反应，将无色的（ABTS）转化为可视化的蓝绿自由基阳离子（ABTS+）。特定靶分子触发多个PDz分子的释放，放大信号。结合等温核酸序列扩增，该方法可在不到2小时内检测到从NASBA提取的0.1 pg和10 pg总RNA中产生的16S rRNA和katG mRNA扩增子，并产生可见信号。[1]

图1 sDz/PDz级联系统的设计原理

斯坦福大学医学院Matthew Bogyo教授设计了一种检测Mtb的新型诊断探针—快速、发光、廉价的Hip1 ( FLASH )传感器，可用于结核分枝杆菌蛋白激酶Hip 1的检测，并且可以区分活细胞和死细胞。Hip1是一种细胞被膜相关的丝氨酸蛋白酶，对Mtb毒力及其在巨噬细胞中的存活至关重要。Hip1切割Mtb蛋白GroEL2，有助于抑制早期巨噬细胞的促炎反应。该团队将Hip 1的选择性四肽底物通过中间连接子对氨基苄醇与苯氧基-二氧杂环丁烷发光团偶联。四肽底物对结核分枝杆菌蛋白激酶Hip 1有较高的选择性，通过酶催化裂解。在酶切后，苯胺连接子发生自发消除，释放出活化的苯氧基二氧杂环丁烷发光体。随后的化学激发和衰减过程导致了光的自发产生。活的Mtb表达有活性的Hip1，它处理探针产生光。用灵敏的光度仪测量发射光，并随时间积分，以产生总的发光信号[2]。

图2 快速发光传感器Hip1 （FLASH）的设计原理

南卡罗莱纳大学刘畅教授通过Click反应将抗原转化为DNA探针并定量其特征信号，展示了一种具有多种扩增机制的纳米孔检测方法，可达原子摩尔水平的检测限，从而可以定量人血清中循环结核分枝杆菌（Mtb）抗原ESAT-6/CFP-10复合物。首先捕获抗体修饰的dynabeads从血清样品中免疫沉淀ESAT-6/CFP-10抗原复合物，然后特异性结合检测抗体修饰的CuO纳米颗粒，形成夹心结构。接着，通过磁性分离夹心结构，盐酸释放Cu+以催化DNA-炔烃（DNA-A）与叠氮基金刚烷（AA）之间的点击反应，扩增形成DNA-AA。最后，与CB[6]的主客体相互作用形成DNA-AA@CB[6]探针。ssDNA探针通过α溶血素（α-HL）纳米孔的产生了高度特征的特征信号，与DNA-A和DNA-AA的非特异性信号明显区分开来。将纳米孔对ssDNA的单分子灵敏度与催化扩增相结合，产生一种特征信号模式，作为一种通用的生物传感策略用于准确检测和定量。[3]

图3 ESAT-6/CFP-10抗原复合物定量纳米孔法示意图

四川大学华西医院实验医学科应斌武教授团队报告了一种高灵敏度的视觉免疫分析法，用于检测尿液样本中的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）对结核病的诊断。首先在反应孔底部形成双抗体夹心复合物，特异性识别捕获LAM。然后，链霉亲和素（SA）加入孔中与生物素标记的二抗结合。然后生物素标记的T30探针与SA特异性结合。LAM浓度与上清液中游离T30的浓度呈负相关。上清液转移到离心管中进行下一阶段反应，通过原位合成铜纳米粒子（Cu NPs）进行信号放大。Cu²⁺与胸腺嘧啶（T）络合后，被抗坏血酸还原生成Cu NPs，生成量与游离T30浓度正相关，消耗游离Cu²⁺。最后，钙黄绿素和量子点（QDs）通过竞争反应选择性识别Cu²⁺和Cu NPs。反应液中Cu²⁺/Cu NPs浓度比随LAM浓度升高而增加，导致两种信号分子的荧光强度减弱，可视化条带扩散长度缩短。[4]

图4 尿液样本中LAM的可视化免疫分析示意图

华东理工大学张志斌团队结合磁珠优越的分离能力和杂交链反应（HCR）优良的信号放大能力，构建了一种低成本、无酶、灵敏的MTB IS6110基因序列（MTB DNA）检测平台。MTB DNA与H1偶联磁珠（MBs-H1）杂交破坏H1的发夹结构，引发HCR反应。在最佳条件下，该方法对MTB DNA具有良好的荧光响应，最低检测浓度低至10 pM。[5]

图5 基于HCR和MBs的MTB检测概念示意图

四川大学华西医院实验医学科陈飘飘团队建立了一种同时分析结核病患者血液样本中IP-10和IFN-γ的策略，利用纳米材料的选择性鉴定和无酶核酸扩增。以IP-10为例，合成IP-10适配体-P2 dsDNA特异性识别溶液中的IP-10，从中释放P2。胸腺嘧啶碱基在HP2末端与Hg²⁺反应，形成T-Hg²⁺-T发夹结构。P2通过HP2环区识别，形成P2-HP2 dsDNA，Hg²⁺同时释放到混合物中并通过CDs检测。P2-HP2 dsDNA可被辅助环2区识别，释放P2参与CHA循环扩增，产生大量HP2-helper 2 dsDNA，释放更多Hg²⁺到溶液中。以IFN-γ适配体序列为基础，设计CAg⁺- C发夹结构的P1、辅助链1和HP1。溶液中的IFN-γ触发CHA反应，释放Ag⁺。Ag⁺和Hg²⁺分别被CdTe量子点和CDs选择性识别，形成关断信号的报告模式。而非结核病患者没有这种反应。[6]

图6 通过选择性识别和CHA同时均匀敏感荧光定量IP-10和IFN-γ

湖南大学何凤姣团队提出了一种检测结核分枝杆菌菌株H37Rv的电化学传感。该传感器包含一个H37Rv适配体和金纳米颗粒修饰的寡核苷酸（AuNPs-DNA）。该实验室筛选H37Rv适体作为识别探针。采用多通道串联压电石英晶体（MSPQC）系统检测H37Rv存在下AuNPs-DNA介导的频移变化。设计了三种金纳米粒子修饰的寡核苷酸。这些寡核苷酸分别含有12、12和13个碱基与37-nt H37Rv适配体杂交。通过Au-S键将H37Rv适配体固定在金电极表面。然后通过将适体与设计的三个AuNPs-DNA序列杂交形成导电层。当H37Rv存在时，它特异性地与适体结合，导致AuNPs-DNA与电极分离。导电层因此被适体和细菌的非导电复合物所取代。这些变化由MSPQC系统监测。该传感器快速、特异、灵敏，检测时间为2 h，检出限为100 cfu/mL。[7]

参考文献

[1]  Dhar B C, Reed A J, Mitra S, et al. Cascade of deoxyribozymes for the colorimetric analysis of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2020, 165: 112385.

[2]  Babin B M, Fernandez-Cuervo G, Sheng J, et al. Chemiluminescent Protease Probe for Rapid, Sensitive, and Inexpensive Detection of Live Mycobacterium tuberculosis[J]. ACS central science, 2021, 7(5): 803-814.

[3]  Wang X, Wei X, Van Der Zalm M M, et al. Quantitation of Circulating Mycobacterium tuberculosis Antigens by Nanopore Biosensing in Children Evaluated for Pulmonary Tuberculosis in South Africa[J]. ACS Nano, 2023, 17(21): 21093-21104.

[4]  Chen P, Meng Y, Liu T, et al. Sensitive Urine Immunoassay for Visualization of Lipoarabinomannan for Noninvasive Tuberculosis Diagnosis[J]. ACS Nano, 2023, 17(7): 6998-7006.

[5]  Chu Z J, Xiao S J, Liu Y H, et al. Rapid and sensitive detection of the IS6110 gene sequences of Mycobacterium tuberculosis based on hybridization chain reaction and reusable magnetic particles[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2019, 282: 904-909.

[6]  Shi T, Jiang P, Peng W, et al. Nucleic Acid and Nanomaterial Synergistic Amplification Enables Dual Targets of Ultrasensitive Fluorescence Quantification to Improve the Efficacy of Clinical Tuberculosis Diagnosis[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(12): 14510-14519.

[7]  Zhang X, Feng Y, Duan S, et al. Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv Electrochemical Sensor Mediated by Aptamer and AuNPs–DNA[J]. ACS Sensors, 2019, 4(4): 849-855.