无创产前检测（NIPT）已成为一线产前筛查技术。NIPT主要筛查胎儿染色体异常，包括常见的染色体非整倍体和染色体微缺失/微重复综合征，但不能同步筛查单基因病。单基因病也是导致出生缺陷的重要因素，在所有出生缺陷中占比为7.5%~12%，因此，单基因病尤其是新发突变的单基因病防控，是进一步完善出生缺陷防控体系的重要环节。把新发突变的单基因病纳入无创产前筛查，是NIPT进一步发展的技术难点和必然方向。

2024年1月22日，由复旦大学附属妇产科医院牵头、联合浙江大学医学院附属妇产科医院、湖南省妇幼保健院和博昊基因等单位，以黄荷凤院士、张静澜、徐晨明、张丹、王华为共同通讯作者，及张静澜、吴琰婷、陈松长、罗琼、席惠为共同第一作者的研究团队，在国际顶刊Nature Medicine上发表了新一代三合一无创产前筛查的多中心前瞻性临床研究成果，运用创新的无创产前筛查技术——协同等位基因靶向富集测序（COATE-seq），通过分析孕妇血浆中的游离DNA，在临床上首次运用无创的方法全面筛查包括单基因疾病、染色体非整倍体和染色体微缺失综合征等不同类型的胎儿遗传变异。该多中心前瞻性临床研究共1,090名入组的高风险孕妇被纳入分析，与随访结果比较，不但检测准确性高，且胎儿遗传变异的检出率提高了60.7%。通过创新技术的应用，该研究大大拓宽了胎儿遗传性疾病产前筛查的检测范围，在产前诊断领域具有重要的科学意义和临床价值。

新发突变所致的显性单基因病是当前产前筛查的薄弱环节，将其纳入胎儿cfDNA三合一筛查，是NIPT技术发展和临床应用的必然要求，标志着我国在出生缺陷防控领域又取得了一个里程碑式的重要突破，也是我国科学家在这一研究领域获得国际领先优势的标志性成果之一。

引言

出生缺陷是在宫内、出生时或婴儿后期可能出现的结构或功能异常。在活产儿中，出生缺陷的发生率约为2%-4%，而在自然流产和死产中，出生缺陷的发生率更高。染色体畸变和单基因变异是导致出生缺陷的主要因素之一，占潜在病因的13%-15%，大多数遗传病没有有效的治疗方法。

传统的产前筛查依赖于超声成像、母体血清学标志物或侵入性技术，这些方法存在无法对多种不同类型遗传疾病进行同步无创筛查的局限性。母体血浆中胎儿游离DNA（cfDNA）基因检测技术的出现，为导致严重后果的遗传性疾病的产前筛查带来了重大转变，实现了通过非侵入性、分子生物学的方法大幅提高产前筛查的安全性和准确性。但遗传疾病具有从单核苷酸变异到染色体拷贝数变化的高度分子病理的异质性，所以通过孕妇外周血游离DNA检测，分析胎儿种类繁复的遗传疾病仍然困难。

由于母体血浆中大部分cfDNA来源于母亲，高母体cfDNA背景下检测胎儿特有变异存在困难，许多遗传性疾病NIPT还无法检测。为应对海量的遗传性出生缺陷，亟需开发一项临床有效、安全可靠、并可全面同时筛查染色体及单基因病的新型无创产前检测，提高胎儿遗传病的检出率，为孕妇及医生在妊娠的决策和管理过程中提供更加安全、及时、准确的信息。

黄荷凤院士团队联合博昊基因等单位，在Nature Medicine期刊（2022年IF 87.24；2023年IF 82.90）发表的文章“Prospective prenatal cell-free DNA screening for genetic conditions of heterogenous etiologies”，报告了新一代三合一无创产前筛查的多中心前瞻性临床研究成果。该研究运用创新的无创产前筛查技术——协同等位基因靶向富集测序（COATE-seq），通过分析孕妇血浆中的游离DNA，在临床上首次运用无创的方法，全面筛查包括胎儿单基因疾病和染色体异常等不同类型的遗传变异。该项研究中，COATE-seq涵盖了7种常见染色体非整倍体和9种微缺失综合征，以及与显性单基因病相关的75个基因。在入组的1,090例高风险妊娠中检出135例阳性病例，其检测敏感性达98.5%，特异性为99.3%。并且相比于传统的只包括染色体疾病的NIPT筛查，COATE-seq提高对致病性遗传变异的检出率达到60.7%。

据文章介绍，COATE-seq与国内常用的低深度全基因组测序方法相比，它在检测胎儿游离DNA中的单核苷酸多态性（SNP）方面展现出显著优势。这种技术通过有效降低等位基因的杂交偏好，能够更精准地检测cfDNA中的等位基因频率，这种高精度的检测方法使得COATE-seq能够更有效地区分母胎来源的cfDNA，从而提高检测的准确性。COATE-seq在生物信息学分析方面也取得了重大进展, 通过同时分析等位基因频率和测序深度可以显著提升染色体异常的检测精度。此外，COATE-seq在检测单基因病的点突变方面也表现出色。由于胎儿游离DNA在母体血液中的比例相对较低，传统方法在母体背景下检测胎儿的单基因变异通常较为困难。然而，COATE-seq通过高深度测序获取等位基因频率，并结合cfDNA片段的大小分布信息，提高了单基因变异检测的特异性。

研究结果

产前cfDNA三合一综合筛查的临床有效性

该研究是一项针对胎儿染色体非整倍体、微缺失和单基因遗传病的三合一综合性无创产前筛查的多中心前瞻性临床研究，旨在评估一种采用COATE-seq的新型产前筛查方法的临床有效性和检测能力。在2021年4月24日至2022年9月10日间，来自中国不同省份的三家妇产医院的1191名胎儿遗传病高风险孕妇被纳入这项前瞻性临床研究。所有参与者都接受了产前细胞游离DNA（cfDNA）的综合性无创产前三合一筛查（NIPT2 Pro），其包括了7种常见染色体非整倍体和9种微缺失综合征，以及与显性单基因病相关的75个基因。通过胎儿超声检查和其他产前筛查来判断前瞻性观察队列中的高风险孕妇的入组。有101名参与者被排除，其中71例没有胎儿胚系变异的诊断结果，15例是目标基因组区域的母体变异干扰了胎儿基因分析，8例测序深度不符合要求，7例的测序数据因多胎妊娠或样本污染而未能通过单胎妊娠质量控制（图1）。

最终队列（N=1,090）中所有孕妇的胎儿都是罹患遗传病的高风险：876例（80.4%）胎儿超声异常，116例（10.6%）母体血清学筛查结果异常，86例（7.9%）标准cfDNA（NIPT或NIPT Plus）染色体筛查结果为高风险，12例（1.1%）曾有不良妊娠史，提示胎儿患遗传病风险的增加（表1）。在最终队列（N=1,090）的所有参与者中，cfDNA三合一筛查在135名（12.4%）孕妇中发现了致病性基因变异，并通过诊断检测得到确认，其中包括89例非整倍体、9例微缺失和37例单基因变异（表2）。相比于传统的只包括染色体疾病的NIPT筛查，在产前筛查中引入单基因病同步筛查时，其遗传变异的检出率提高了60.7%。

图1：针对多种遗传疾病的产前cfDNA三合一综合筛查临床研究共有1,191名孕妇参加了这项研究。其中，101例被剔除，包括无诊断结果的71例、母亲携带目标区域变异的15例、测序深度质量控制要求不合格的8例、多胎妊娠或样本污染导致单胎质量控制要求不合格的7例。最终，对1,090个病例进行了进一步分析，通过新的筛查方法确定了135例妊娠，其中包括89例非整倍体、9例微缺失和37例单基因病。

表1. 入组统计和临床特征

在cfDNA三合一筛查中有6例假阳性，其诊断结果均为阴性。使用不同的分析方法（包括低深度全基因组测序的NIPT）进行标准cfDNA筛查时，这些孕妇的筛查结果均为阳性。此外，还有两例T21假阴性病例（诊断结果为阳性），在传统cfDNA筛查中也是阴性。鉴于上述8个病例都是两种不同的方法得出错误的筛查结果，它们不太可能是由cfDNA筛查中的分析误差造成的，而可能是由胎儿和胎盘的基因差异造成。在产前cfDNA筛查和诊断中，已知限制性胎盘嵌合和胎儿限制性变异（胎盘中不存在）是导致结果差异的因素。

虽然cfDNA三合一筛查有8例不正确的染色体结果，但在该研究中筛查的37例阳性和966例阴性的单基因病病例中没有任何错误结果（图1和表2），对单基因病筛查的临床灵敏度和特异性均为100%，没有假阳性和假阴性。

表2. 产前cfDNA三合一综合筛查的临床效果

就检测表征而言，876例有胎儿结构异常的孕妇中，有98例（11.2%）发现了上述遗传变异；86例染色体疾病标准cfDNA筛查高风险结果的孕妇中，有35例（40.7%）发现了上述遗传变异；116例血清筛查高风险的孕妇中，有2例（1.7%）发现了上述遗传变异。在其余12例既往妊娠史提示遗传病高风险的孕妇中，没有发现任何病例（扩展数据表3）。总体而言，cfDNA三合一筛查对所有筛查疾病的临床灵敏度为98.5%（95% CI，94.3%-99.7%），特异性为99.3%（95% CI，98.4%-99.7%）（表2）。这些数值是将筛查结果与金标准诊断结果进行比较后得出的（表3）。阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为95.7%（95% CI，173 90.6%-98.3%）和99.8%（95% CI，99.1%-100%）。

对于非整倍体、微缺失和单基因病，检测灵敏度分别97.8%（95% CI，175 91.5%-99.6%）、100%（95% CI，62.9%-100%）和100%（95% CI，88.3%-100%），检测特异性分别为99.4%（95% CI，98.6%-99.8%）、100%（95% CI，99.6%-100%）和100%（99.5%-100%）；非整倍体、微缺失和单基因病受试者工作特征曲线下面积（AUC）分别为0.996、1.000和1.000（表2）。

表3. 通过产前cfDNA三合一综合筛查高风险并诊断确认的单基因病胎儿

产前cfDNA三合一综合筛查针对胎儿结构异常的检出率

该研究还观察到，对染色体异常和单基因疾病的并行产前筛查，可以揭示与表型相关的关键数据。超声筛查发现结构异常的876个胎儿（P1-P98）中，有98个（11.2%）诊断出了基因变异。其中，42例（42.9%）为常见常染色体非整倍体（T21、T18和T13），13例（13.3%）为性染色体非整倍体，6例（6.1%）为微缺失，37例（37.8%）为单基因病（图2A、表3）。基因变异诊断的检出率在淋巴系统异常中最高（36.9%），其中32.6%检出染色体异常，而仅4.3%的病例由单基因致病变异引起。在骨骼畸形胎儿中，23.5%检出单基因致病变异，而染色体异常的比例仅为1.2%。值得特别注意的是，研究中有13个未表现出大脑或中枢神经系统异常的胎儿，但检出了与神经系统损伤相关的致病变异。总体而言，在有胎儿结构异常的孕妇中，当把目标单基因病与染色体病结合起来分析时，基因变异诊断的检出率增加了60.7%（从61到98）。

产前超声检查的局限性意味着，一些单基因疾病（如Rett综合征）在产前可能不表现任何症状，而其他一些病症（如软骨发育不全）可能直到孕中期或晚期才通过超声波检查发现。cfDNA的三合一筛查（NIPT2 Pro）可以在孕早期发现尚未表现症状的患病胎儿，这对临床决策至关重要。需要注意的是，与这75个基因相关的单基因病是专门为入组高风险人群选择的。对于扩展性人群，应采用更严格的标准，重点关注表型严重、早期发病、发病率高和检测方法性能高的疾病。

图2.综合性无创产前筛查在胎儿结构异常的妊娠中诊断性遗传变异的检出率

在876例胎儿结构异常妊娠中，有98例（11.2%）检测到基因变异。其中42例（42.9%）为常见的常染色体非整倍体，13例（13.3%）为性染色体非整倍体，6例（6.1%）为微缺失，37例（37.8%）为单基因病。B.在所有876例胎儿结构异常妊娠中，基因变异的检出率最高的是淋巴系统异常（36.9%），其次是骨骼异常（24.7%）和多系统异常（23.3%）。染色体异常的检出率在淋巴系统异常中最高（32.6%），其次是多系统异常（19.2%）、颈部透明带增厚（8.8%）、心脏缺陷（5.7%）和颅面异常（5.7%）。单基因病的检出率最高的是骨骼异常（23.5%），其次是淋巴系统异常（4.3%）、多系统异常（4.1%）、FGR（2.9%）和大脑异常（2.2%）。NT：颈部透明带。FGR：胎儿生长受限。

产前cfDNA三合一综合筛查参与者的妊娠结局

妊娠结局数据一直追踪到产后6周。在1090名接受了cfDNA三合一筛查和诊断流程的合格参与者中，有623例（57.2%）活产，268例（24.6%）选择流产，2例（0.2%）自然流产。参与者中有197人（18.1%）没有妊娠结局数据。他们在其中一家参与医院登记并进行了产前诊断，但在其他临床护理中心进行了诊断后管理和/或分娩。

在诊断结果为阳性的137个病例中，11例（8.0%）活产，106例（77.4%）选择流产，1例（0.7%）自然流产，19例（13.9%）妊娠结局不明（扩展数据表7）。其中100例经超声检查发现胎儿异常，其中4例（4.0%）活产，82例（82.0%）选择流产，13例（13.0%）妊娠结局不明。对妊娠结局和所有产后和/或产前临床检查进行了评估，未发现遗传诊断与临床检查之间存在出入。所有临床妊娠管理决策均以诊断结果为依据。在所有有妊娠结局数据的病例中，未发现与进行cfDNA筛查或诊断有关的不良事件。

cfDNA三合一综合筛查能极大提高无创筛查临床有效性

该项研究强调了全面的胎儿cfDNA分析在增强严重遗传性疾病产前诊断方面的潜力。COATE-seq技术与国内常用的低深度全基因组测序方法不同，通过有效降低等位基因杂交的偏好等技术创新，可更精准地检测胎儿cfDNA单核苷酸多态性（SNP）的等位基因频率。这种方法可以改善遗传风险的早期检测，促进知情的产前干预、围产期管理，并帮助父母的生殖决策。

该研究表明，相比于传统的只包括染色体疾病的NIPT筛查，在产前筛查中引入单基因病同步筛查时，其遗传变异的检出率提高了60.7%，筛查效率更高。此外，我们注意到，入组的86例NIPT或NIPT Plus筛查胎儿染色体疾病高风险孕妇中，只有35例产前诊断确诊，假阳性标本51例，PPV为40.7%（35/86），这与国内多个大样本临床队列数据相当。而该研究应用COATE-seq技术对这86个样本检测的PPV提高到了85.4%（35/41）！且筛查的6个假阳性孕妇，NIPT筛查也是假阳性，可能为限制性胎盘嵌合。可见，新一代三合一无创产前筛查对染色体异常的检测准确性也有很大提高，这将大幅减少孕妇不必要的羊水穿刺。

该研究的主要目的是评估新型三合一无创产前检测技术COATE-seq的检测效能，因此参与者限定为高风险孕妇。cfDNA筛查检测过程中不太常见或复杂的遗传变异方面的表现仍不确定。黄荷凤院士研究团队在文章中指出需要将单基因病纳入针对普通妊娠的无创产前筛查的规则，把cfDNA三合一筛查（NIPT2 Pro）推广到更广泛的孕妇人群，需要更明确的疾病包含准则。为此，该研究提出了一个名为“SEPH”疾病选择的优先级考量体系，作者指出应该优先纳入那些表型严重（severe outcome）、早期发病（early onset）、发病率较高（prevalent incidence）且检测方法性能高（high performance）的疾病。更细致的疾病选择标准，确定纳入疾病的发病率阈值、表型严重程度量化指标等，这些标准将有助于优化筛查流程，确保筛查的临床实用性。

总之，这项多中心前瞻性队列研究比较了cfDNA筛查和诊断性检测的结果，支持了产前cfDNA三合一筛查（该筛查包括人类遗传病最常见的三种病因：非整倍体、微缺失和单基因变异）的临床有效性。鉴于其结果准确并显著提高了检出率，产前cfDNA三合一筛查值得作为一种无创评估胎儿异质性遗传病风险的工具来进一步探索和临床应用。未来的研究将涉及对不同产科人群进行更大规模的研究，以评估扩大产前cfDNA筛查的更广泛的临床效用。

结语

该研究引入了一种有价值的方法来加强产前护理，扩大可识别的胎儿遗传筛查的范围，大幅领先于传统产前筛查的能力。COATE-seq技术的核心创新在于其对不同等位基因的无偏好靶向富集探针设计，这一点突破了传统探针设计的限制，不仅实现了更加精准地检测染色体非整倍体和染色体微缺失，还高效地在NIPT中整合了单基因疾病。

黄荷凤院士团队在多中心前瞻性研究中通过细致的个案随访解决了先前研究缺乏纵向分析的缺点。因此，cfDNA三合一无创产前筛查（NIPT2 Pro）在准确检测胎儿遗传性疾病方面的有效性，得到了大量真实临床证据的验证。方法的开发和临床验证都需要各个学术机构和产科医院的多个团队的特殊协调，还重视实际临床应用中的有效性和适用性，在推动科学技术进步的同时，确保新技术能更安全、有效地服务于广大孕妇，在临床上提高妊娠管理的质量和效果。在推广至临床应用后，将为孕妇及医生在妊娠的决策和管理过程中提供更加安全、及时、准确的信息，标志着在遗传病检测和出生缺陷防控领域的一个里程碑式的重要突破。

2022年10月，黄荷凤院士团队和博昊基因还在Cell Discovery上联合发表了新一代三合一无创产前筛查的方法学和回顾性临床研究成果。据悉，在回顾性临床研究和高风险孕妇的多中心前瞻性临床研究的基础上，新一代三合一无创产前筛查项目已获十四五国家重点专项——“多种类型遗传疾病的无创产前同步式筛查新技术与临床研究”资助，黄荷凤院士和徐晨明研究员将牵头进行新一代三合一无创产前10万普通孕妇队列的临床研究。让我们共同期待更多全球领先的研究成果和临床检测新技术面世。