小分子背景简介
小分子即小分子化合物，是指分子量通常低于1000道尔顿、结构简单的化合物。我们常见的小分子物质包括生理激素、农兽药残留、生物毒素等。小分子检测在临床医学诊断、环境监测、食品安全控制等领域具有重大意义，尤其是在医学诊断领域，随着小分子研究的深入，其临床应用也越来越广泛。
临床应用方面常见的小分子有很多，如T3、T4、雌二醇、孕酮、醛固酮、25羟基维生素D、他克莫司、环孢霉素等。
临床上常见的小分子化合物
然而，由于小分子本身结构的特点，其分子体积和空间位阻受限；且小分子物质通常也只有一个抗原表位，仅有反应原性，没有免疫原性，很难产生免疫应答，只有通过与大分子蛋白或者载体蛋白结合，形成“完全抗原”，才能具有免疫原性，产生特异性识别小分子抗原的抗体。
小分子常见检测方法分析
小分子化合物在医学检验中得到应用的方法主要包括LC-MS/MS和化学发光免疫分析方法。
LC-MS/MS检测方法
LC-MS/MS检测方法历来是小分子物质检测的金标准，该方法通过小分子物质的质荷比进行精确定量，具有较高的准确性和特异性。
LC-MS/MS方法一般包括样本前处理、液相色谱的分离和质谱检测。在整个流程中，前处理环节是整个分析过程中最关键且耗时最长的步骤，包括溶液制备、样本准备、样本提取、蛋白沉淀、离心、浓缩和复溶等步骤。
尤其针对血液样本这类包含有各种蛋白质、盐离子等与目标分析物无关的物质的复杂标本，LC-MS/MS的前处理更为繁琐，而且不同分析物的处理方式不同，具有分析物依赖的特殊性。比如25(OH)D在前处理过程中需要额外进行碱化分离结合蛋白；雌二醇样本在进入LC-MS/MS分析前还需要进行额外的丹磺酰氯衍生化增强离子化效率等。因而，前处理的质量很大程度决定了后续质谱检测的准确性。
目前来看，LC-MS/MS方法现阶段很难在医学检验端普及开来。因为不仅需要较昂贵的仪器设备和专业操作人员，样品常常还需要进行特殊处理，同时还存在有机溶剂接触风险、耗时费力、通量小等局限性。
化学发光免疫竞争法
在化学发光免疫检测技术领域，由于小分子物质分子质量小，仅有单一抗原决定簇，无法提供2个及以上的表位与抗体结合，因此传统的夹心法不能用于小分子物质的检测，现阶段主流厂家均采用免疫竞争法检测小分子物质。
在竞争法反应体系中，由于包被的抗体量以及标记的抗原量都是有限的，不利于抗原抗体的温育，检测范围和灵敏度受限；同时，竞争法采用单株抗体，也更容易受到交叉干扰影响。
竞争法通常会采用标记抗原衍生物的方式进行竞争检测，但是抗原衍生物制备过程中可能会出现抗原表位部分或者全部被标记物占据的情况，从而导致抗原衍生物对抗体的亲和力降低。而且，抗原衍生物和分析物抗原本身结构会存在微小的差异，对同一株抗体的亲和力往往很难保持一致，导致竞争过程的不平衡。另外，竞争法中分析物浓度与反应信号值呈负相关，在低浓度区段反应信号很难与零区别开来，低值区域的相对误差较大。
所以化学发光免疫竞争法在检测小分子化合物时，很难与LC-MS/MS检测结果有良好的一致性。前期大量的研究显示，对于小分子25羟基维生素D和醛固酮，化学发光免疫竞争法与质谱检测结果之间一致性较差。
25羟基维生素D主流竞争法厂家与质谱检测结果比对
醛固酮主流竞争法厂家与质谱检测结果比对
综上，化学发光免疫竞争法检测小分子物质在灵敏度、特异性、准确性等分析性能方面还是存在诸多的局限性，也进一步限制了在临床上的广泛使用。
小分子检测在临床应用层面的困境
目前，市场上常见的小分子检测产品主要包括25羟基维生素D、醛固酮、雌二醇、睾酮等。同时受限于目前的检测技术水平，多数小分子物质的临床应用价值还有待于进一步深入挖掘和分析。
25(OH)D检测
25羟基维生素D（25(OH)D）的检测主要用于判断个体内维生素D的营养状况，准确测定需要能够同时检出25(OH)D2和25(OH)D3。
美国疾控中心（CDC）统计了参与维生素D标准化项目（VDSP）的所有厂家的数据，结果表明，不同厂家检测结果与LC-MS/MS之间的一致性堪忧，维生素D免疫学检测的标准化建设任重道远。
维生素D标准化项目各厂家与参考方法比对
同时，当患者服用维生素D2的补剂或者药物，样本中含有不同浓度的25(OH)D2时，相关性欠缺，整体偏差较大，说明目前的免疫竞争法还难以准确定量检测25(OH)D2。
各免疫学方法在不同含量25OHVD2时与质谱方法比较
研究报道，25(OH)D在检测过程中容易受到3-epi-25(OH)D3同分异构体的交叉干扰影响，同时血液中存在的大量的维生素D结合蛋白也会对免疫学检测造成影响，在目前25(OH)D质谱检测已经具有较好的准确性的同时，免疫学检测还有很长的路要走。
维生素D结合蛋白对免疫学方法检测25羟基维生素D的影响
醛固酮检测
醛固酮检测主要用于原发性醛固酮增多症的筛查和确诊，已有研究报道，免疫学检测醛固酮和LC-MS/MS之间存在一致性和相关性欠缺的问题，尤其是小于100pg/mL的低浓度区段，免疫学检测结果普遍偏高。
另外，免疫学检测醛固酮并未实现标准化，因此各厂家之间的结果可比性也较差。2022年卫健委发布的醛固酮能力验证报告显示，化学发光法检测醛固酮相较于质谱靶值存在较大偏倚，尤其是低浓度样本，个别组偏倚甚至高达114.3%。
醛固酮低值区域免疫竞争法和质谱检测比对
有研究者提出，由于抗体特异性不足，部分免疫分析法检测的醛固酮含量实际为醛固酮与其代谢产物醛固酮3C葡萄糖苷酸等含量之和，从而造成测试结果的偏高。而临床上根据目前应用的场景和积累的临床证据，针对醛固酮单独设定截断值，并从以往的100pg/ml以上下调至100pg/ml以下，这对于现阶段的竞争免疫分析方法提出了巨大的挑战。
雌二醇检测
雌二醇的检测通常用于生长发育、辅助生殖监测等方面，这一类人群雌二醇的浓度水平都较高，对灵敏度要求并不高。但是研究发现，小于20pg/mL的低浓度雌二醇的应用场景也非常广泛，然而免疫学的检测还不够灵敏。多项研究表明，在男性、青春期前的儿童以及绝经后女性这类雌二醇浓度较低的人群中，采用免疫学检测雌二醇和LC-MS/MS方法之间高度不一致，相关系数普遍较低。
同时，雌二醇常用于服用氟维司群的乳腺癌患者的治疗监测，研究发现，氟维司群会引起交叉反应，导致雌二醇测试结果偏高，因此，现阶段的竞争法极大的限制了雌二醇检测在生理浓度较低的人群中临床价值的探索。
睾酮检测
睾酮检测可以用于前列腺癌的临床管理。前列腺癌具有雄激素依赖特征，我国转移性前列腺癌占新发病例的54%，而雄激素剥夺治疗是目前主要的治疗手段。
多年前国际公认的去势水平是睾酮低于50ng/dL（1.735nmol/L），受限于当时的检测技术水平，现有的方法证实手术去势后睾酮的平均水平是15ng/dL，因此睾酮＜20ng/dL（0.694nmol/L）应该是比较合理的去势水平。治疗期间睾酮下降到更低水平（深度降酮）与更佳的疾病预后和转归相关。
睾酮管理贯穿前列腺癌诊断、评估、治疗及预后评价多个过程，对于不同疾病阶段的患者均具有重要临床意义，现阶段市场主流免疫竞争法试剂的灵敏度还存在一定的局限性。高灵敏睾酮检测如何应用于前列腺癌的治疗监测还有待于进一步探索。
小分子LC-MS/MS检测方法现阶段存在较多的局限性，如样本前处理难以标准化和统一，尤其是临床血液样本处理难度大、耗时，导致在医学检验端使用受限。
对于化学发光免疫竞争法来说，虽然具有操作简便、检测通量高等优势；但由于采用单株抗体、定量抗体环境中进行竞争反应，存在与金标准质谱检测结果一致性差，特异性不高以及检测灵敏度差等问题。
医学检验服务临床诊断，作为医生的眼睛。每当困境出现的时候，就是技术创新驱动力诞生的时候，她将推动技术以及技术背后材料发生革命性突破。
在下期中，我们将一同探讨小分子化合物检测技术的发展，是否能找到一种兼顾LC-MS/MS检测方法和化学发光免疫分析法两种技术优势的方法！操作类似化学发光检测技术一样简便，一管血离心后直接上机检测；准确度可比肩金标准LC-MS/MS检测方法。
【参考文献】
[1]王亚辉, 李彦伸, 宋丽廷, 等. 小分子化合物非竞争免疫检测方法研究概述[J]. 食品与生物技术学报, 2017, 36(2): 113-121.
[2]Piran U, Riordan W J, Livshin L A. New noncompetitive immunoassays of small analytes[J]. Clinical chemistry, 1995, 41(7): 986-990.
[3]Chen F, Cheng Z, Peng Y, et al. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based assay for simultaneous quantification of aldosterone, renin activity, and angiotensin II in human plasma[J]. Journal of Chromatography B, 2021, 1179: 122740.
[4]Wise S A, Camara J E, Sempos C T, et al. Vitamin D Standardization Program (VDSP) intralaboratory study for the assessment of 25-hydroxyvitamin D assay variability and bias[J]. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 2021, 212: 105917.
[5]Tolan N V, Yoon E J, Brady A R, et al. Price of high-throughput 25-hydroxyvitamin D immunoassays: Frequency of inaccurate results[J]. The Journal of Applied Laboratory Medicine, 2018, 2(6): 868-879.
[6]周伟燕,张传宝,马文君,蔡军,陈文祥.加强我国醛固酮标准化和肾素一致化建设[J].中华检验医学杂志,2020,43(3):245-249.
[7]Wise S A, Camara J E, Burdette C Q, et al. Interlaboratory comparison of 25-hydroxyvitamin D assays: Vitamin D Standardization Program (VDSP) Intercomparison Study 2—Part 1 liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) assays—impact of 3-epi-25-hydroxyvitamin D3 on assay performance[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2022, 414(1): 333-349.
[8]Heijboer AC, Blankenstein MA, Kema IP, Buijs MM. Accuracy of 6 routine 25-hydroxyvitamin D assays: influence of vitamin D binding protein concentration. Clin Chem. 2012 Mar;58(3):543-8.
[9]Blocki F, Zierold C, Olson G, Seeman J, Cummings S, Bonelli F. In defense of aldosterone measurement by immunoassay: a broader perspective. Clin Chem Lab Med. 2017 Mar 1;55(4):e87-e89.
[10]Owen L J, Monaghan P J, Armstrong A, et al. Oestradiol measurement during fulvestrant treatment for breast cancer[J]. British Journal of Cancer, 2019, 120(4): 404-406.
[11]禹松林,方慧玲,程歆琦,张瑞苹,韩建华,秦绪珍,夏良裕,苏薇,程倩,邱玲.五种自动化免疫学方法和液相色谱串联质谱方法测定25羟维生素D的比较[J].中华检验医学杂志,2015,38(7):475-479.
[12]Rosner W, Hankinson S E, Sluss P M, et al. Challenges to the measurement of estradiol: an endocrine society position statement[J]. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2013, 98(4): 1376-1387.
[13]Naruse M, Katabami T, Shibata H, et al. Japan Endocrine Society clinical practice guideline for the diagnosis and management of primary aldosteronism 2021[J]. Endocrine Journal, 2022, 69(4): 327-359.
[14]国家卫生健康委员会，前列腺癌诊疗指南. （2022年版）.
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