人类肠道病毒71型 (EV71) 是手足口病 (HFMD) 的主要病原体之一，偶尔会引起严重的神经系统并发症。有临床证据表明，EV71感染会增加严重手足口病患者血清中的外泌体，提示外泌体在EV71发病机制中的作用，但其功能尚未完全阐明。 

　　为了深入探究外泌体在EV71感染中的作用，2022年10月5日暨南大学病原微生物研究院罗震课题组在Frontiers in Microbiology上发表了题为“Enterovirus 71 non-structural protein 3A hijacks vacuolar protein sorting 25 to boost exosome biogenesis to facilitate viral replication”的研究。该研究发现EV71感染细胞诱导外泌体分泌增加，并找到EV71 3A蛋白与宿主Vacuolar protein sorting 25 (VPS25) 蛋白相互作用，促进外泌体分泌。进一步利用 siRNA沉默技术和外泌体生物发生抑制剂实验，揭示VPS25介导的外泌体产生可促进EV71感染。暨南大学病原微生物研究院2018级硕士阮志慧和2020级博士生梁艺聪为论文的共同第一作者，暨南大学病原微生物研究院罗震副研究员和吴建国教授为共同通讯作者。研究得到了国家自然科学基金等项目支持。 

　　图1：肠道病毒 71 (EV71) 感染促进外泌体生物发生 

　　该研究首先提取EV71感染的细胞上清液中的外泌体，通过透射电子显微镜 (TEM) 分析观察到提取的细胞外囊泡具有典型的外泌体结构。并通过NTA测量外泌体的直径和颗粒数，同时对其蛋白质浓度进行测量。结果表明，EV71感染细胞分泌的外泌体的颗粒数量和蛋白质浓度均显著高于未感染细胞。通过蛋白质印迹法进一步验证提取的外泌体中标志物 HRS、Tsg101、CD9 和 CD63 蛋白的含量。作者进一步在外泌体上使用膜染料Dil和荧光团偶联的CD9抗体进行了免疫染色，显示外泌体被Dil特异性染色，并与CD9蛋白共定位。 

　　图2：EV71 3A蛋白与VPS25相互作用 

　　通过前期筛选，作者发现EV71的非结构蛋白可特异性地促进外泌体产生。在表达的GFP或GFP-3A蛋白细胞裂解物中，作者使用GFP抗体进行了免疫沉淀，通过 SDS-PAGE分离可能与3A蛋白相互作用的细胞蛋白。接下来，Co-IP分析、免疫荧光共定位分析和双分子荧光互补测定实验显示VPS25可以和3A蛋白相互作用。提示3A蛋白与VPS25相互作用促进外泌体的产生。 

　　图3：VPS25蛋白介导EV71诱导的外泌体产生 

　　随后，通过siRNA沉默技术敲低VPS25蛋白表达，发现siVPS25-1#可显著降低EV71 3A蛋白过表达和EV71感染诱导的外泌体产生，说明VPS25蛋白介导EV71诱导的外泌体产生。 

　　图4：VPS25介导 EV71 诱导的外泌体以促进病毒复制 

　　论文的最后，作者探讨了VPS25介导的外泌体在EV71生活周期的影响。在EV71感染后8和12 h的早期阶段，相对于siNC，用siVPS25-1# 转染的细胞中病毒蛋白VP1和3A的表达不受影响；当EV71感染细胞达24 h时，病毒蛋白VP1和3A的病毒表达显著降低，表明在第一轮感染后抑制细胞内EV71复制。在平行实验中，siVPS25-1#显著降低了后代EV71的滴度。此外，当细胞以剂量依赖性方式转染 siVPS25-1# 时，EV71诱导的细胞毒性显著降低。结果说明，VPS25介导 EV71 诱导的外泌体可促进病毒复制。 

　　图5：GW4869通过抑制EV71诱导的外泌体生物产生来抑制病毒复制 

　　类似地，考虑到GW4869是一种外泌体生物发生/释放抑制剂，它靶向内吞途径中的nSMase以调节外泌体生物发生。在细胞裂解物中，GW4869不影响Calnexin、HRS、Tsg101、CD9、CD63 和VPS25的内源性表达。在外泌体中，EV71增加了VPS25的蛋白水平以及HRS、Tsg101、CD9 和 CD63，而这种诱导在GW4869存在下显著降低。在EV71感染后，GW4869存在下，细胞EV71 3A蛋白表达量明显降低。 

　　在8和12 h后，GW4869不影响EV71 VP1蛋白的表达，说明GW4869对早期EV71胞内复制没有明显影响。在24 h后，在EV71感染后用GW4869处理的细胞中，病毒蛋白VP1和3A的表达被显著抑制，同时，GW4869明显降低了子代EV71的滴度。此外，当细胞以剂量依赖性方式暴露于GW4869 时，EV71诱导的细胞毒性显著降低。这进一步证实，抑制 EV71 诱导的外泌体，可有效地抑制病毒复制。 

　　图6：EV71调控外泌体产生，促进病毒复制模式图 

　　几乎所有感染病毒的细胞都可以释放外泌体，这在病毒感染中起着重要作用。本研究揭示了EV71利用外泌体生成途径并与 ESCRT 复合蛋白相互作用以增强病毒复制过程。值得注意的是，除了外泌体，一些细胞外囊泡群（特别是大小> 200 nm）在病毒复制中也有一定的作用。外泌体和其他细胞外囊泡中参与EV71 复制的因素需要在未来的工作中加以阐明。