3、蛋白质检测的发展

蛋白质方法学随时间在发展，为了不同的目的应用了不同的方法。

在测定总的血清蛋白浓度上，临床上开始是检测蛋白质中氮的含量，再来推算蛋白质含量（在国内称为蛋白氮）。这就是Kjeldahl的检测氮的改良方法（凯氏定氮）。这个方法也许至今还依然使用在生物制品确定蛋白质含量。

1921年美国人Howe 叙述了使用硫酸钠溶液分离血浆蛋白为纤维蛋白原、优球蛋白（auglobulin）、和假球蛋白（pseudoglobulin）。依据较早时期的研究，优球蛋白被确定为实际上不溶于水、溶解在稀释的盐溶液（沉淀在蒸馏水中的球蛋白），但在28%~36%的饱和硫酸铵溶液中被沉淀。1937年，Campbell和Hanna引入亚硫酸钠对血液蛋白质进行分离。成为临床实验室使用的盐析经典方法，从血清中将球蛋白分离，余下的为白蛋白。在使用如双缩脲方法（或酚试剂）分别定量球蛋白和白蛋白，确定了白蛋白/球蛋白的比率（A/G）。

Tiselius在1937年叙述了在U-管中以电泳的移动界面分离蛋白。存在的浓度梯度可以折射仪检出。直至1948年开始普遍使用纸电泳进行蛋白分离。

1928年Theodor Svedberg引入分析超离心，开始以斯韦德贝里（Svedberg）常数（S）表示蛋白质的特性。据此按照蛋白质的分子量分类为4S（~65 kDa）、7S（~150 kDa）、和19S （~900 kDa）分子。γ-球蛋白组分，按照它的电泳泳动能力确定，被超离心分为7S和19S组分，7S组分含有IgG、IgA、和IgD；19S组分含有IgM。

不同的非特异方法对蛋白质的定量检测，可参见表2。

许多疾病的诊断要求更多的某些蛋白的精确浓度信息，各个人体蛋白在血浆、血清、脑脊液、和尿液中的定量检测是诊断和监视疾病与治疗有效性上的重要工具。在人体液的复杂基质中特定蛋白的定量，以特定抗体可最有效地实现。在20世纪中期，开始制备和使用抗体作为分析工具。这是在Michael Heidelberger和Forrest Kendall在1935年报告了沉淀反应的定量研究，以及RL.Libby于1938年研究了散射的免疫沉淀后。双价抗体和单价蛋白间的结合反应导致许多抗体和蛋白质分子形成了聚集体。（图3）

图3 蛋白质免疫反应聚集示意图

但是一个蛋白的抗原决定簇单价特性，可因蛋白质的重复结构，特别在多聚体蛋白内或因在一个多克隆抗血清内抗体的不同决定簇的特异性，产生了蛋白质抗原与抗体聚集不同表现。无形中，一个蛋白质的很多免疫反应决定簇，可以与各个对应抗体产生特异免疫反应。而一个蛋白质相应地，也成为了免疫学中多价的可溶性蛋白质抗原。

免疫化学分析中，一个多价的可溶性蛋白质抗原与它相应抗体（Ab）在一个免疫化学检测中的结合，是一个平衡反应，发生在系列的不同步骤，如下所述（b、d、m、x、和y为整数，且b、d＜m＜x、y）：

1、在起始反应中，抗原Ag和抗体Ab快速结合，形成（AgAb）抗原抗体复合物；

2、形成免疫复合物AgAbm，并缓慢地增长（AgdAbm+b）；

3、在免疫复合物中，抗原和抗体分子数增加，一旦达到临界大小，最后产生沉淀（AgxAby）。

在反应中分子大小实质性的增大，不仅在溶液中产生了沉淀，而且也改变了沉积和扩散系数，以及改变了光散射的行为。

Michael Heidelberger和Forrest Kendall于1935年检测了被沉淀的抗体量，第一个以定量词语叙述了“免疫沉淀反应”。在他们的实验中，他们将不断增加的抗原，加到具有相同抗体浓度的系列溶液中。

图4 在恒定抗体浓度下增加抗原浓度的免疫沉淀反应。

在抗原浓度和被沉淀的抗体间关系的一般形式，参见图4。经常被称为“Heidelberger-Kendall曲线”，可分为三个不同的区域：

1、“抗体过剩”是第一个区域（A），出现较低的Ag/Ab比率，形成少量沉淀；但随着抗原

浓度增加，发生越来越多的沉淀。

2、“平衡区带”是第二个区域（B），抗原和抗体浓度具有最佳比率。随着更多抗原与抗体结合，达到了最大形成沉淀点。在溶液中，存在很少或没有游离抗原或游离抗体。

3、“抗原过剩”是第三个区域（C），Ag/Ab比率升高。因为很高的抗原浓度，形成很小的、可溶性的免疫复合物。与较大的沉淀物相比，Ag2Ab 的整体组成更多。这些小的复合物没有大至从溶液中析出，也无法被普通的光散射检测出来。

这个曲线的原理结构展现了，每一个免疫化学反应中的特性特征。这个独特的曲线表现特别需要注意的是，无论使用散射免疫比浊还是免疫透射比浊，它们的检测信号指示了一个相同的信号读数（被抗体沉淀的），有两个可能抗原浓度；一个检测是在抗体过剩区域，另一个在抗原过剩区域。某个检测方法的抗体浓度水平被设定在抗体过剩区，确保了所有预期抗原浓度处于抗体过剩状态，这样的检测结果可靠有效。在凝胶方法的抗原单向扩散方法中，抗原向含有抗体的凝胶移动，在加样孔处表现为抗原过剩，不会出现抗原抗体复合物的沉淀。抗原向外扩散到抗原和抗体间比率变化恒定下，实现抗原抗复合物达到最大沉淀，呈直线或环状沉淀线。实验室可以测量沉淀线的直径，与标准抗原结果比较，得到样品中存在的抗原量。

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