文章来源：中华检验医学杂志, 2022,45(4) : 428-432

作者：李锦潮 肖斌 宣俊峰 孙朝晖 李林海

摘要

多重核酸检测技术具有可同时检测多个靶标、高通量、低成本等优势，满足大规模筛查、定量等检测需求。多重聚合酶链反应广泛应用于病原体、甲基化DNA和突变基因检测以及单核苷酸多态性分型；重组聚合酶扩增、环介导等温扩增等等温扩增技术在即时检测领域有很好的前景；基于规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统的多重核酸检测技术因其高灵敏度、高特异性成为新的研究热点；而宏基因测序在新发病原体突变监测和肿瘤学研究等领域发挥主导作用。本文对各种多核酸检测技术的临床应用现状及未来发展方向进行论述。

多重核酸检测技术是指在同一反应管中同时进行多个核酸靶标扩增与检测的技术，基于核酸扩增与检测原理，主要分为多重聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、多重等温扩增技术（isothermal amplification technology，ITA）、基于规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein，CRISPR/Cas）的多重核酸检测技术以及宏基因组测序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）。不同检测技术各有优势，其检测原理和应用场景也各具特点（表1）。

一、多重PCR

多重PCR是临床应用最广泛的多重核酸检测技术，目前主要用于细菌、病毒的检测与定量、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）分型、疾病突变基因、启动子甲基化的检测。其基本原理是在同一PCR反应体系中加入多对特异性引物，同时扩增、检测多个目的基因。Chamberlain等［1］报道多重PCR时就已经实现了6重扩增，ThermoFisher公司的多重PCR试剂盒能实现20重扩增；PrimerPlex、iCubate2.0等软件可以实现多重PCR引物与探针的设计与优化，从而降低非特异性扩增的可能。本章主要介绍各种荧光定量检测方法。

（一）TaqMan探针

TaqMan探针能够与靶序列互补结合，在PCR反应延伸阶段被Taq酶水解使其5′端的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，游离的荧光基团在激发光作用下释放特定波长的荧光信号。基于TaqMan探针的多重PCR临床应用的意义多样。主流的新型冠状病毒核酸检测试剂盒可同时检测多个靶点以避免因基因突变或核酸降解造成假阴性［2］，也可同时检测靶标与管家基因，以实现病原体的相对定量［3］；或者用于精确区分临床症状相似的感染性病原体［4］。典型TaqMan探针不能识别单碱基突变，而核酸类似物锁核酸（locked nucleic acid，LNA）和小沟结合物（minor groove binder，MGB）均能缩短探针长度、提高探针Tm值，使其具有识别单碱基错配的能力。Zhao等［5］基于TaqMan-LNA探针建立了结核分枝杆菌多重RT-qPCR检测体系，实现了对利福平耐药基因单碱基突变的识别；Xue等［6］利用TaqMan-MGB探针设计了3组双重PCR，能准确识别出人线粒体多个单碱基突变位点。

（二）分子信标

分子信标是一种非水解寡核苷酸探针，其荧光基团与淬灭基团相互靠近不产生荧光信号；当分子信标与靶标互补结合后自身构象发生变化，使荧光基团与淬灭基团分离，在相应激发光作用下释放特定的荧光信号。分子信标能够识别单碱基突变，可用于SNP分型和熔解曲线分析［7］。分子信标的背景荧光极低，PCR体系中同时存在10多种分子信标依旧有很好的检测效能。Chakravorty等［8］利用分子信标多重PCR，开发了能同时检测多重耐药结核分枝杆菌rrs、inhA、gyrA1、eis2等9个耐药基因以及1个扩增内标的10重检测体系，检测极限达到300 CFU。Marras等［9］将FAM、TET、Alexa-594、Alexa-568等6种荧光基团组成15对独特的分子信标组合，实现对产气荚膜梭菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌等15种病原体特异性基因质粒的15重检测。

（三）HRM分析

HRM分析是基于非特异性双链DNA结合染料的荧光定量PCR，通过熔解曲线形状和峰值位置的微小差异来区分不同靶标，从而实现多重核酸检测。该方法无需特异性探针、标记引物以及二次开管等。HRM分析需要使用饱和的DNA染料，有研究表明，非特异性双链核酸染料SYBR Green Ⅰ浓度变化会影响熔解曲线形状和靶标熔解温度（melting temperature，Tm），当浓度高于2 μmol/L时会明显抑制PCR反应，而SYTO9浓度在0.5~10 μmol/L范围内均未出现明显的抑制作用，其浓度变化也不影响熔解峰的形状与位置［10］。因此HRM分析常使用SYTO、LCGreen等无碱基偏好性、PCR扩增抑制不明显且精密度好的核酸染料［11］。HRM常用于SNP分析、等位基因纯杂合子鉴别、基因突变和启动子甲基化水平检测［12］。Salviato等［13］利用HRM分析成功检出血友病B患者F9基因碱基变异，精确识别出不同位点的碱基突变。

基于TaqMan探针的多重PCR已经成为常规的感染性病原体核酸检测方法。分子信标探针主要用于基因筛查和SNP分型。HRM分析筛查突变基因的成本更低。然而传统的PCR技术正面临着NGS的挑战。

二、等温扩增技术

相较于PCR，等温扩增技术具有反应迅速、检测设备微型化、不依赖于温度循环仪等多个优点。本章节主要介绍多重RPA和多重LAMP的研究进展和临床应用。

（一）多重RPA

RPA体系包括重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶3种基本的酶。RPA在37~42 ℃恒温条件下反应20~30 min即可完成核酸扩增［14］，临床上主要应用于病原体的快速检测。为了平衡多重RPA中各待测靶标的扩增速率，需要进行引物对筛选并优化引物浓度。研究表明，在引物的5′端附着一段通用引物序列后，可以一定程度上缩小各反应间扩增效率的差距［15］。RPA扩增产物可通过荧光定量和侧流层析试纸条检测。

1. 多重荧光定量RPA：Exo探针是多重荧光定量RPA最常用的探针。Exo探针的核酸序列中含有四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）碱基位点，核酸两端标记有荧光基团与淬灭基团。当探针与靶序列互补结合后，核酸外切酶Ⅲ（exonuclease Ⅲ，Exo）能识别并切割THF位点使荧光基团与淬灭基团分离，从而实现对靶标的特异性检测。Li等［16］基于Exo探针建立了肠病毒71型、柯萨奇病毒A16型以及扩增内标的3重RT-RPA，以RT-qPCR为金标准，检测肠病毒71型、柯萨奇病毒A16型的敏感度分别为92.3%、99.0%，特异度分别为99.7 %与100%。

2. 多重RPA侧流层析试纸条法：此方法的基本原理是对扩增产物进行双标记，再利用抗体-抗原反应在试纸条不同位置捕获特异性扩增产物。主流的试纸条法是向反应体系中加入核酸外切酶Ⅳ（endonuclease Ⅳ，nfo）和带有特异性基团标记的nfo探针，在nfo酶的作用下可形成特异性双标记扩增产物。Sun等［17］基于此方法建立了检测甲型流感病毒和乙型流感病毒的双重RT-RPA，2种病毒的最低检出限分别为500拷贝与50拷贝；Zhai等［18］在建立淋病奈瑟菌与沙眼衣原体两重RPA体系时，直接将生物素与FAM标记在前引物上，地高辛标记后引物；并检测79份病临床样本，两种病原体的检测敏感度分别为85.62%与90.90%。多重RPA侧流层析试纸条法不依赖于荧光检测装置，可通过手握、腋窝夹持反应管进行加热，但只能进行半定量检测，其灵敏度也弱于荧光检测法。

3. 固相RPA：也称芯片RPA，其基本原理是将扩增反应的一条引物固定在芯片或者数字视频光盘DVD表面的特定区域，通过位置来区分不同扩增反应，因此可依靠化学发光法等手段进行荧光检测。此方法的优点在于各区域的扩增反应相互独立，引物固定在芯片表面也可减少二聚体形成。Kersting等［19］基于固相RPA建立了检测金黄色葡萄球菌、肠道沙门菌、淋病奈瑟菌与扩增内参的4重RPA，3种细菌的最低检出限分别为10拷贝、10拷贝与100拷贝。

目前，多重RPA主要应用于食品卫生、农牧业等领域，其灵敏度低、定量能力较差，尚不能满足乙型肝炎病毒等病原体的检测需求。固相RPA则将核酸检测体系一体化、模块化，简化了反应流程。

（二）多重LAMP

LAMP是由Notomi等［20］在2000年开发的等温扩增技术，在60~65 ℃下反应30~60 min即可完成核酸扩增。单个LAMP扩增反应需要2对或者3对引物，多重LAMP的引物数量成倍增加，容易出现非特异性扩增。目前尚未有能与LAMP反应体系兼容的核酸外切酶或内切酶，也缺乏成熟的特异性荧光检测手段，主要通过反应液浑浊度、颜色或者pH值变化等非特异性手段检测LAMP扩增产物。

1. 多重荧光定量LAMP：分子信标在LAMP反应体系中背景荧光强、缺乏特异性［21］，而Sherrill-Mix等［22］发现，在分子信标核酸序列中加入多个核酸类似物LNA后，能提高分子信标茎-环结构的稳定性，提高其与靶序列的结合力和检测特异性。该团队开发出检测新型冠状病毒小包膜糖蛋白基因与人唾液富酪蛋白基因的双重LAMP，新型冠状病毒最低检出限达到125拷贝。Becherer等［23］开发出媒介置换法：当前环状引物参与扩增反应时，结合在前环状引物上的媒介序列会被置换下来，并与特异性探针互补结合，使探针变构并释放荧光信号。该团队利用此方法实现了梅毒螺旋体和杜克嗜血杆菌的双重检测。但此方法是通过引物消耗来表示扩增反应，并不能区分非特异性扩增与特异性扩增。

2. 多重LAMP侧流层析试纸条法：Zhu等［24］将双重RT-LAMP与侧流层析试纸条结合，建立新冠病毒双重检测体系，分别用异硫氰酸荧光素与地高辛标记ORF1ab与N基因的前环状引物，用生物素标记脱氧核糖核苷三磷酸，经过LAMP扩增形成异硫氰酸荧光素/地高辛加生物素双标记的扩增产物，生物素与显色染料相结合，而异硫氰酸荧光素与地高辛分别被试纸条上相应的抗体条带所捕获，从而实现双重检测。

三、基于CRISPR/Cas的多重核酸检测技术

高灵敏度、高特异度的CRISPR/Cas核酸检测技术有望取代PCR的传统地位，在便携式、即时检测领域前景广阔。

2017年Gootenberg等［25］将RPA、T7转录与Cas13a整合为SHERLOCK技术平台，用于DNA或RNA快速检测。该团队利用Cas13蛋白的“连带剪切”偏好性，结合4种Cas13蛋白和AsCas12a开发出5重核酸检测技术SHERLOCKv2［26, 27］。Abudayyeh等［28］基于LwaCas13a、PsmCas13b实现对大豆草甘膦抗性基因CP4 EPSPS以及大豆管家基因LE1的双重检测。

Xiong等［29］基于双重RT-RPA、CRISPR/Cas9以及侧流层析试纸条构建了检测新型冠状病毒E基因与ORF1ab基因的双重RT-RPA。此团队设计的单引导RNA（single guide RNA，sgRNA）既能与目标序列特异性结合，也能与胶体金上的DNA探针结合，形成生物素或地高辛-扩增子-Cas9/sgRNA-胶体金复合物，从而实现双重检测；利用该方法检测64份新型冠状病毒肺炎疑似患者的咽拭子样本，与RT-qPCR相比，其阳性符合率、阴性符合率分别达97.14%与100%。

在SHEROLOCKv2体系中，一些Cas13蛋白核酸检测效率受CRISPR来源RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）序列影响，需要进行crRNA筛选，增加了设计成本。此外，crRNA、sgRNA和探针需要-80 ℃保存，试剂运输储存成本高，不合适在医疗资源匮乏的场景使用。

四、mNGS

mNGS能够对待测样本中所有DNA或者RNA进行无选择性测序，在肿瘤与感染性疾病的临床诊断中发挥重要作用。Papaemmanuil等［30］对1 540例急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）患者的外周血进行mNGS测序，分析突变位点频率与疾病预后的相关性，绘制了AML的基因分型图谱，从而更好地指导个性化治疗。mNGS检测成本相对较高，耗时长，临床上仍不能将其作为病原体的常规检测手段，目前主要用于新发病原体和传统方法难以检出的感染性疾病病原体的快速检测；中国疾病预防控制中心等机构通过mNGS在新型冠状病毒肺炎暴发初期便获得新冠病毒全基因序列，为疾病的诊断和流行病学调查提供了及时的证据［31］；Salzberg等［32］对10例疑似中枢神经系统感染但PCR和细菌培养无法确诊的患者进行mNGS测序后，明确了其中7例患者的感染情况，从而提高了中枢神经系统感染性病原体的检出率。

包括mNGS、RNA-seq在内的新一代测序技术在临床诊断和科学研究中发挥越来越重要的作用。随着测序成本的降低、检测时间的缩短以及生物信息分析的成熟，mNGS极有可能成为临床病原微生物常规的检验手段。

五、总结

基于TaqMan探针的多重PCR已成为病原体检测、SNP分型、DNA甲基化等领域的重要检测工具；分子信标的低背景荧光使得其多重检测效能优于TaqMan探针；HRM作为一种高效低成本的单碱基识别方法，在快速低通量基因鉴定中的潜力较大。等温扩增技术在即时便携检测领域优势明显，但多重RPA的检测灵敏度仍有待提高，多重LAMP则需要成熟的检测方案。随着测序成本的降低和检测周期的缩短，mNGS很可能成为临床实验室的常规检测技术。综上所述，多核酸检测技术的快速发展，将提供快速、简便、多元化的核酸检测方案，极大提高疾病和病原微生物的检测能力。