作者：欧铜， 张兵， 张秀明
（深圳市罗湖区人民医院检验科，广东 深圳 518001）
文章来源：检验医学，2022，37（4）：303-308

摘要

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情严重危及人类健康和社会经济发展。临床实验室精准的病原学检测是疫情防控的前提。目前，新型冠状病毒实验室检测技术主要包括核酸检测、抗体检测和抗原检测。核酸检测灵敏度高、特异性强，是诊断COVID-19的“金标准”，但对人员、技术、设备、场地等要求高；抗体检测作为核酸检测的补充，可减少漏检，监测疾病进展，但人群普遍接种新型冠状病毒疫苗后会产生“假阳性”；抗原检测方便、快捷，可居家操作，但灵敏度受疾病进程和病毒载量影响大。为了提高大规模核酸检测效率，国家卫生健康委先后推出了5合1、10合1、20合1不同比例的混采检测技术，但因混采管保存液体积成倍增加会导致病毒稀释，有一定的漏检风险，并会使单采复核与流调工作量剧增。随着疫情的持续，病毒株不断变异，实验室检测技术也在不断更新迭代。准确分析、研判现有检测技术的优劣和应用场景，更有利于疫情的科学防控。文章围绕核酸检测“混采”与“混检”、病毒变异对核酸检测性能的影响、核酸检测试剂“内源性”和“外源性”内标的优劣、抗原检测的意义和应用场景、疫苗接种后抗体检测的价值等关键技术问题进行分析，并提出应用建议。

关键词

新型冠状病毒；实验室检测；病毒变异；分析性能

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情的全球大流行危害严重。新型冠状病毒的实验室检测在COVID-19确诊、传播链阻断及疫情防控中发挥着重要作用。新型冠状病毒基因组破译后，基于病毒特异性基因序列研发的荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）核酸检测技术，为COVID-19的确诊提供了灵敏度高、特异性好的实验室检测方法。人体感染新型冠状病毒后会发生特异性免疫反应，在血清中先后出现IgM、IgG抗体。血清学抗体检测联合核酸检测可减少漏诊，实时监测疾病的进展。人群普遍接种新型冠状病毒疫苗后，给血清学抗体检测结果的解读带来了挑战，但通过检测血清中和抗体，有助于评估疫苗接种后的群体免疫力。新型冠状病毒抗原检测主要靶向病毒自身蛋白，虽灵敏度低于核酸检测，但操作便捷，可快速获得检测结果，且不受疫苗接种影响。为了高效应对大规模核酸检测，国家卫生健康委先后出台了“混检”与不同规格“混采”的技术指引与规范。随着疫情与常态化防控的持续，实验室检测技术也在更新迭代，对现有检测技术的优劣和应用场景进行再认识与思考，有利于疫情的科学防控。本文在新型冠状病毒实验室检测工作实践的基础上，结合文献调研，对5个关键技术问题进行分析，并提出应用建议。

1　核酸检测不同规格“混采”与“混检”

快速筛查对控制新型冠状病毒传播至关重要。考虑到核酸检测能力、效率和卫生资源压力，国家卫生健康委分别于2020年7月21日、8月17日、2022年1月15日发布了《新冠病毒核酸筛查稀释混样检测技术指引》《新冠病毒核酸10合1混采检测技术规范》和《关于印发新冠病毒核酸20合1混采检测技术规范的通知》，推荐使用稀释混合检测、10合1混采和20合1混采检测，以加快新型冠状病毒筛查效率，及时阻断传播链，节约社会资源。

实验室稀释混合检测也称为单采混检。混采目前比较常用的是5合1、10合1或20合1的方式。任何现有的汇集检测策略，无论是汇集样本还是提取核酸，都不可避免地要稀释病毒。一般来说，汇集样本的数量越多，产生假阴性的可能性就越大。假设扩增效率为100%，按循环阈值（cycle threshold，Ct）（标本荧光强度达到检测限需要扩增的循环数）大小与原始模板量之间的关系：浓度2倍稀释，Ct值升高1.00；浓度4倍稀释，Ct值升高2.00；浓度10倍稀释，Ct值升高3.32。目前，新型冠状病毒核酸检测单人单管病毒保存液为3 mL，5合1混采管病毒保存液为3 mL, 不影响病毒浓度; 10合1混采管病毒保存液为6 mL，病毒浓度是单人单管的1/2，弱阳性标本有可能被漏检；20合1混采病毒管保存液为12 mL，与单人单管相比病毒被4倍稀释，弱阳性标本更有可能被漏检。如果混采结果为阳性，则需对混采的几个受试者暂时隔离，并重新采集单管拭子进行复核。存在的问题是，需要对所有人员重新单采检测，使流调难度大大增加，而且所有样本都要重新提取核酸重新检测，有可能贻误时机，造成病毒在人群中的传播。虽然2合1混检与10合1混采的灵敏度相同，4合1混检与20合1混采的灵敏度相同，但混检阳性时，实验室只需要对原样本单独提取核酸和检测即可，可在短时间内锁定阳性样本，极大地方便了后续的流调工作，防控效率提高，但对医疗机构来讲，检测成本会相应增加。

罗颖等提出了一种联合混采与混检的混合样本池策略，能够在单一实时荧光定量PCR检测孔中准确地筛查超过90个样本，同时保持极低的假阴性率，适用于COVID-19发病率低地区的大规模筛查和监测。董宏杰等在新型冠状病毒混合检测中，采用注射器纯化柱法从全部样本的混合保存液中提取核酸，稀释混样检测时，可将混合人数上限由20提高到50。

综上所述，从流调效率来讲，混检的防控效果要优于混采；从节省检测成本的角度出发，混采优于混检。不同品牌的检测试剂盒性能有所不同，建议选择灵敏度较高的逆转录PCR试剂；目前的新型冠状病毒核酸检测试剂盒的阳性判读Ct值一般为40, 整个反应扩增循环数为45, 探索Ct值在38～40的样本, 混采或混检后, 能否在40～45个循环内形成S型扩增曲线具有重要的研判价值。无论是混采还是混检，都可提高总体检测效率，有助于疫情的防控。但应注意的是，随着社区病例数的不断增多，单个样本的检测需求量也会增大，而混合检测并不能代替这种需求。

2　病毒变异对核酸检测性能的影响

核酸检测依赖于寡核苷酸（引物和探针）与病毒基因组中各自靶序列之间的特异性杂交，通过荧光定量PCR仪进行扩增，实现对病毒的检测。基于早期大流行传播的新型冠状病毒株序列，引物和探针靶向的RNA序列可以位于编码结构蛋白[包膜（envelope，E）蛋白、刺突（spike，S）蛋白、核衣壳（nucleocapsid，N） 蛋白] 的基因中， 或者位于开放阅读框（ORF1ab）中。随着疫情的全球大流行，已出现了不少传播力、致病力和免疫原性各异的病毒变异株。大多学者认为，现有的核酸检测试剂盒大部分都是针对新型冠状病毒2个及以上基因设计多组特异性引物与探针，只要其中1组引物与探针检测成功即判定为可疑阳性，新出现的变异恰好都在各组引物上的概率很低，因此核酸检测试剂盒受病毒变异的影响不大。针对我国8 488家实验室开展的新型冠状病毒Delta变异株核酸检测室间质量评价结果显示，同浓度水平的Delta变异株和非变异株样本符合率差异无统计学意义（P>0.05），提示Delta变异株未影响我国现有核酸检测试剂的适用性。有学者使用瑞士罗氏公司核酸试剂检测时发现，虽然8例26340C>U突变的样本E基因全部漏检，但ORF1ab基因均被检出。也有学者认为，ORF1ab、S、E和N靶基因的突变可能会干扰逆转录PCR检测的特异性，但大多是基于生物信息学的分析，不能真实反映临床应用中的诊断性能。因此，在资源有限时，为了避免新型冠状病毒变异株的某一突变位点引起靶标基因检测假阴性结果，建议实验室使用针对新型冠状病毒2个及以上独立的基因区域进行检测的试剂。同时，应及时使用不同品牌的核酸检测试剂对单靶标阳性的核酸标本进行复核。

3　核酸检测试剂“内源性”和“外源性”内标的优劣

内标为同一反应体系中与靶序列共同检测的一段非靶序列分子，用于监控检测流程。内标有2种形式，一种是利用天然样品中含有的基因序列（内源性内标），另一种是在检测过程中人工添加的外源性序列（外源性内标）。

内源性内标通常选择不同个体间序列保守且在各组织与细胞中表达相对稳定的基因，如GAPDH、β-actin、18sRNA等管家基因。内源性内标与靶基因处理程序完全相同，具有监控采样、运输、核酸提取与扩增全流程优势，但人体细胞或组织与病毒颗粒存在一定的基因提取效率差异，且环境样本中因无人体组织或细胞，无法对内源性内标进行平行检测。外源性内标根据非靶序列存在的形式常分为2种：一种是直接添加不会干扰靶序列扩增的人工合成非靶序列在扩增反应体系中与模板一起扩增，监测扩增过程；另一种是人工合成的假病毒，如MS2噬菌体，在核酸提取前被加入到提取体系中，假病毒包被的非靶序列内参参与核酸提取与扩增，监控检测过程。外源性内标无法监控采样与运输过程，但因其与靶序列的存在形式相似，能更精细地监测提取与扩增过程，对环境样本同样有效。

目前的大规模筛查多采用5合1、10合1混采检测，部分地区已采用20合1混采检测，1管混采标本，无论是5合1、10合1，还是20合1，只要其中1个样本采样合格，整管样本利用内源性内标进行采样-检测全流程监测，其检测结果即为合格，这使内源性内标的监控采样至扩增全流程的优势无法发挥。内源性内标只针对单采样本，如隔离点、封控区的重点人群采样，才能体现出全流程监控的优势。虽然在大规模核酸检测过程中，因混采技术的使用，内源性内标无法有效监测采样过程，但可节省添加内标的实验环节，在大批量样本检测过程中，可减少实验室工作量，快速出具报告。外源性内标在进行环境样本检测方面具有一定优势，因环境样本中不存在内源性内标，对应的内源性内标试剂无法检测到内标，即无法监测提取与扩增过程，而在每份样品中加入等量的外源性内标进行提取与扩增，因内标添加量稳定，扩增曲线趋于一致，可监控每个样本提取与扩增情况。

综上所述，外源性和内源性内标各有优劣，目前尚无文件明确哪种更好，获得我国国家药品监督管理局认证的新型冠状病毒核酸检测试剂盒既有采用内源性内标的方式，也有采用外源性内标的方式。因此，在检测中可根据实验室的不同需求与应用场景灵活选择，综合应用。

4　抗原检测的意义与应用场景

随着具有超强传播能力的奥密克戎（Omicron）毒株的出现，国务院联防联控机制综合组及时优化了疫情防控策略，印发了《新型冠状病毒抗原检测应用方案（试行）》，开始推进“抗原筛查、核酸诊断”的监测模式。同时，国家卫生健康委和国家中医药管理局也发布了《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》，将抗原检测作为核酸检测的补充。

抗原检测试剂的应用依赖于诊断性能、COVID-19流行率、感染症状及标本质量等多种因素。世界卫生组织在针对新型冠状病毒感染诊断的抗原检测指南中指出，基于新型冠状病毒自检快速抗原检测的使用，其临床性能与专业快速抗原检测相当，与核酸检测相比, 快速抗原检测应满足最低性能要求, 即敏感性≥80%, 特异性≥97%。截至2022年4月12日，我国国家药品监督管理局批准的抗原检测试剂盒已增至34个。德国保罗埃利希研究所对欧盟市售的122种抗原检测试剂进行了性能评估，结果显示，以标本PCR检测结果（Ct值）≤25，敏感性>75%作为产品合格标准，不同品牌试剂的敏感性差异大，其中有96种试剂满足要求，26种试剂敏感性为0%～58.8%，20种试剂检测Ct值≤25的标本时，敏感性可达100%，Ct值为25～30时，敏感性>75%。目前流行的新型冠状病毒感染以无症状为主。有研究结果显示，抗原检测试剂筛查无症状感染者的敏感性为28.8%～51.5%，特异性89.2%～99.5%，以1%感染流行率推测抗原试剂阴性预测值>99%，阳性预测值<50%。提示在我国新型冠状病毒感染流行率低的区域不适合进行大规模抗原筛查。抗原检测对传染期的病毒具有较高敏感性，感染者一般在感染第3～7天病毒载量最高，因此抗原检测更适用于处于感染到发病1周内的人群的筛查，有利于“早发现、早诊断、早隔离、早治疗”的防控需求，可以实现早期分级管理。由于抗原检测在15～30 min即可出结果，即采即检，与核酸检测相比，可大大提高检测效率，且方便、快捷、成本低，普通民众可居家检测，便于分流有新型冠状病毒核酸检测需求的人群，有效缓解核酸检测压力。作为自测试剂，采样的质量是抗原检测关键的影响因素，但随着抗原试剂的推广使用，大量视频宣传等均对采样操作进行了标准示范，有助于保障居民居家隔离抗原试剂检测的准确性。

结合应用方案、国内外疫情防控政策及抗原应用条件，新型冠状病毒抗原检测可考虑应用的场景包括：（1）基层医疗机构发热门诊的快速分诊，尤其适用于伴有呼吸道、发热等症状且出现症状5 d以内的人群；（2）存在聚集性暴发的潜在风险的场景，如集中在封闭或半封闭环境的人群，包括学校、疗养院、游轮、监狱、工作场所和宿舍；（3）重点场所的监测，如人流密集的机场、火车站、海关、定点隔离机构等，采用抗原联合核酸筛查定期监测，可前移筛查关口；（4）封控区、管控区、居家隔离人员等的筛查，可提高封控和管控社区的管理效率。新型冠状病毒抗原检测方法学包括荧光免疫层析、胶体金、乳胶法等，除手工检测外，还有便携式仪器检测和自动化检测设备被相继研发出来，可适用不同场景。因此，在常态化疫情防控中，抗原检测有利于有症状或潜在感染高风险人群的快速筛查和分流。

5　疫苗接种后抗体检测的价值

抗体是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。机体感染新型冠状病毒后，先产生血清特异性抗体IgA，发病约1周后产生IgM抗体，最后出现IgG抗体，IgM抗体水平增高提示近期急性感染，IgG抗体水平增高提示既往感染。在接种新型冠状病毒疫苗后，机体会产生“中和抗体”，中和抗体来源于IgM、IgG和IgA中的一部分，通过结合病毒表面S蛋白，阻断其与细胞表面血管紧张素转换酶2受体的结合，进而阻止病毒侵入细胞。

目前，国内外已有多种新型冠状病毒抗体检测试剂获批上市，包括总抗体、IgA、IgM、IgG和中和抗体检测试剂。随着对疾病认识的深入和诊疗经验的积累，为进一步加强早诊、早治方针的实施，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第九版）》明确规定：未接种新型冠状病毒疫苗者新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体均为阳性，可作为疑似病例确诊的证据之一。特异性抗体可作为COVID-19辅助诊断的指标，可联合核酸检测对疑似病例进行分析，还可用于COVID-19患者的治疗监测。

截至2022年4月11日，全球新型冠状病毒疫苗的接种率为64%，我国接种率高达88%。因此，随着全球新型冠状病毒疫苗接种的普及，中和抗体检测可评估疫苗接种后的免疫效果，包括参与辅助疫苗开发、疫苗免疫效果评估、疫苗保护力阈值研究和疫苗持久性研究。TENBUSCH等对接种不同类型新型冠状病毒疫苗后的人群进行了中和抗体的评估，发现异源接种加强针疫苗的效果更优。TADA等分析了基于mRNA和腺病毒载体疫苗产生抗体对变异假型新型冠状病毒的中和能力，发现接种BNT162b2和mRNA-1273后产生的抗体对新型冠状病毒多种变异株表现出适度的中和抗性，而接种Ad26.COV2.S后产生的抗体的中和滴度较低。DORIA-ROSE等通过中和抗体的动态监测，对新型冠状病毒疫苗接种效果的持久性进行评估，发现接种疫苗200 d后，仍具有较高的中和抗体滴度。

综上所述，在未接种新型冠状病毒疫苗人群中，特异性IgG、IgM抗体阳性对核酸检测阴性的COVID-19疑似患者的确诊具有重要意义。在接种了新型冠状病毒疫苗人群中，病毒中和抗体的动态监测具有重要参考价值，有助于确定疫苗保护力阈值，且对中和抗体水平进行更长时间的持续定量检测，还有助于评估是否需要加强免疫。

6　结语

随着疫情的持续，核酸检测、抗体检测、抗原检测这3种实验室检测技术在新型冠状病毒筛查与COVID-19诊断中相互结合，逐步完善，以适应不同阶段疫情防控的需求，为疫情防控提供实验室数据支持。（1）核酸检测敏感性和准确性最高；（2）高滴度病毒载量条件下快速抗原检测有助于提高诊断效率，在大流行时期或者潜在感染率较高的重点场所与封闭管控区域，抗原检测可快速分流人群，降低聚集感染风险；（3）无症状感染者主要来自密接或重点关注人群，为减少因采样部位病毒载量不足导致的漏检，联合特异性IgM、IgG抗体检测来动态监测机体免疫反应具有重要意义。COVID-19已在全球流行近3年，建立群体免疫屏障有助于早日结束疫情大流行，在与病毒赛跑的过程中，各种实验室检测技术的合理应用是关键。