第三代测序技术是指单分子实时测序技术，也叫从头测序技术。与前两代测序技术相比，其最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。就当前形势来看，第二代短读长测序技术在测序市场上仍然占有绝对优势，但第三代测序技术近年来也发展的如火如荼，且已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。其中，英国牛津纳米孔公司所开发的纳米孔（Nanopore）测序技术便是三代测序中的中流砥柱。

什么是Nanopore测序？

图片来源：Oxford Nanopore Technologies官网Nanopore

测序原理：

纳米孔测序，顾名思义，核心就是利用一个纳米孔，孔内共价结合有分子接头，将纳米孔蛋白固定在电阻膜上后，再利用动力蛋白牵引核酸穿过纳米孔。当核酸通过纳米孔时使电荷发生变化，从而引起电阻膜上电流的变化。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，因此不同碱基通过蛋白纳米孔时对电流产生的干扰不同，通过实时监测并解码这些电流信号便可确定碱基序列，从而实现测序。

Nanopore测序中发挥着重要作用的几种物质：

图片来源:Oxford Nanopore Technologies官网

Reader——跨膜蛋白，可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过人为基因工程修饰后，得到Nanopore测序所需的Reader蛋白。Membrane——多聚物薄膜，Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。Motor——马达蛋白，在Nanopore文库构建时，需要在接头上连接一种马达蛋白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。Tether——用于锚定DNA或RNA链，防止其在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。

Nanopore测序的具体流程如何？

Nanopore测序过程：解螺旋，将双链DNA解开成单链；DNA单链分子通过一个孔道蛋白，孔道中有个充当转换器的蛋白分子；DNA单分子停留在孔道中，有一些离子通过带来电流变化，而不同的碱基带来的电流变化不同；转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化；根据电流变化的频谱，应用模式识别算法得到碱基序列。

Nanopore测序技术的优势在哪？

主要优势：

长读长：Reads可达Mb；

设备成本低：测序芯片可清洗再生，重复利用；

实时获得序列信息：最快可在1小时内完成测序流程及数据分析，满足动态检测宏基因组需求；

便携式测序装置：重量轻且占用空间小，可以随身携带随时测序；

直接测序：直接测序原始DNA和RNA，不需要进行PCR扩增，避免了扩增偏好性；保留了原始碱基修饰信息，能够直接读出甲基化的胞嘧啶。

Nanopore测序技术的应用前景如何？

应用方向：

#1 大基因组拼接  

在以往基于短片段的基因组拼接中，由于一些动植物基因组本身具有多倍体，高度重复，高度杂合的特性，导致基因组拼接异常艰难。而Nanopore测序技术具有长读长的特点，利于大基因组的拼接，可以极大的提高基因组的完整性。 

#2 全长转录组     

以往的转录组分析由于无法直接对RNA进行测序，往往需要先对mRNA进行打断，再反转录为cDNA，无法获取和分析全长转录本。Nanopore的长读长特点可以准确识别各基因的多个同源异构体，简单准确；并且可以直接测序RNA，直接识别RNA的碱基修饰。

#3 大片段结构变异

基因组上会产生很多与人类疾病相关的大片段结构变异（如缺失、倒位和易位等），短测序读长无法准确检测这些变异，而Nanopore测序的读长较长，适合进行大片段结构变异的检测，在疾病研究等方面具有良好的发展前景。 

#4 微生物快速鉴定 

由于Nanopore测序具有实时，快速的特点，可以在采集点直接进行测序，实时得到序列信息进行物种分类鉴定，完成微生物的快速鉴定。