病毒的入侵及释放是决定病毒传染性及致病性的重要因素。β冠状病毒家族通过溶酶体外泌通路(lysosomal exocytosis)，将运输到溶酶体的病毒颗粒释放至宿主细胞外[1]。在溶酶体外泌的过程中，结合于溶酶体上的BORC-ARL8b复合物介导溶酶体在微管上的正向运输，即将溶酶体从细胞核方向运输至细胞膜附近，并通过溶酶体膜与细胞膜的融合而将溶酶体内容物释放至细胞外。该膜融合过程由包括STX4、VAMP7和SNAP23的SNARE复合体介导，并且这个过程需要细胞内或局部钙浓度的上调[2,3]。目前我们对于新冠蛋白如何调控溶酶体外泌所介导的病毒分泌机制知之甚少。 

　　β冠状病毒家族如非典病毒(SARS-CoV)、新冠病毒(SARS-CoV 2)和鼠肝炎病毒(MHV)均为正链RNA病毒。SARS和新冠病毒利用其表面的刺突糖蛋白(Spike Glycoprotein, S蛋白)与细胞表面受体ACE2结合而进入宿主细胞，重塑宿主细胞内的关键细胞器，以进行病毒复制、装配和释放。相比与非典病毒，新冠病毒具有更高的传染性和致病性。研究新冠病毒和非典病毒蛋白的功能差异，对于我们认识新冠病毒的高传染性和开发新型治疗方法至关重要。大量研究表明新冠病毒S蛋白的受体结合结构域 (receptor-binding domain, RBD) 比非典病毒S蛋白的RBD具有更高的ACE2亲和性，并且包含一个非典病毒S蛋白不存在的蛋白酶Furin的位点，这些特征使新冠病毒能够更高效的侵染宿主细胞[4,5]。张宏团队前期发表于Developmental Cell杂志上的研究发现，新冠病毒编码的辅助蛋白ORF3a定位于晚期内吞体/溶酶体上，通过阻断自噬体与溶酶体的融合而抑制自噬活性，帮助病毒逃脱宿主细胞内的自噬监控。但非典病毒的ORF3a却并不具备这样的功能[6]。 

　　2021年10月10日，中国科学院生物物理研究所张宏课题组在Developmental Cell杂志在线发表了题为ORF3a of SARS-CoV-2 promotes lysosomal exocytosis-mediated viral egress 的研究论文。该文揭示了SARS-CoV-2编码的辅助蛋白ORF3a通过招募BORC复合体和溶酶体外泌相关的SNARE蛋白而促进溶酶体外泌，并发现了导致新冠病毒ORF3a和非典病毒ORF3a在溶酶体外泌和细胞自噬过程中起不同作用的关键氨基酸位点。 

　　LAMP1是溶酶体膜蛋白，在溶酶体外泌过程中随着溶酶体膜与细胞膜融合而定位于细胞膜表面[7,8]。该研究发现，与对照细胞相比，细胞质膜定位的LAMP1在ORF3a表达细胞中明显增加。这说明表达ORF3a能够有效促进溶酶体外泌。同时，介导溶酶体外泌的BORC复合体关键组分BORCS6，介导溶酶体膜与质膜融合的SNARE组分VAMP7和STX4均能够被ORF3a招募而形成大量点状结构（图1）。这些组分能够与ORF3a直接相互作用且有明显的共定位。在ORF3a表达细胞中敲减这些基因，能够有效抑制细胞膜上LAMP1的异常增加。 

　　图1. 新冠病毒的ORF3a促进溶酶体外泌 

　　张宏团队之前的研究发现新冠病毒的ORF3a通过异常招募HOPS组分VPS39，从而抑制自噬体与溶酶体融合而导致自噬阻滞[6]。本研究发现，被ORF3a招募到溶酶体上的VPS39促进溶酶体外泌。敲减VPS39能够明显抑制OFR3a表达细胞中的溶酶体外泌（图2）。VPS39与BORCS6和STX4有直接的相互作用。而敲减VPS39使ORF3a与STX4和VAMP7的结合明显减弱。 

　　图2. VPS39参与ORF3a介导的溶酶体外泌 

　　进一步的实验结果表明在新冠病毒侵染过程中，细胞膜定位的LAMP1也明显增加。同时，在新冠病毒侵染的细胞中，VAMP7和STX4形成大量明显的点状结构（图3）。缺乏ORF3a同源物的鼠肝炎病毒 (MHV) 也利用溶酶体外泌通路进行病毒分泌[1]。实验结果显示在鼠17Cl-1细胞中表达新冠病毒的ORF3a，能够有效增加细胞培养基中MHV的滴度。这说明表达ORF3a能够促进MHV从宿主细胞中释放。 

　　图3. 新冠病毒感染细胞中溶酶体外泌增强，VAMP7形成的点状结构增加 

　　SARS-CoV-2编码的ORF3a与SARS-CoV编码的ORF3a具有高度同源性，其中约72%的氨基酸是相同的。张泓团队先前研究表明非典病毒编码的ORF3a不能与VPS39相互作用，也不能阻滞细胞自噬[6]。本研究发现，表达非典病毒的ORF3a也不能促进溶酶体外泌。通过依次将新冠病毒ORF3a蛋白与非典病毒ORF3a不同的氨基酸位点进行突变，发现新冠病毒ORF3a蛋白的171位的丝氨酸(S)和193位的色氨酸(W)对于促进溶酶体外泌和阻滞自噬至关重要。将非典病毒ORF3a蛋白的171位谷氨酸(E)和193位精氨酸(R)同时突变为相应位置新冠病毒ORF3a的氨基酸后，非典病毒的ORF3a便能够与VPS39相互作用，并获得阻滞细胞自噬和促进溶酶体外泌的功能。有趣的是，果子狸冠状病毒 (Civet SARS CoV 007/2004) 编码的ORF3a在这两个氨基酸位置上与非典病毒的序列相同，而蝙蝠冠状病毒RaTG13 (Bat coronavirus RaTG13) 以及穿山甲冠状病毒(Pangolin coronavirus) 编码的ORF3a与新冠病毒在这两个位置上的氨基酸相同（图4）。 

　　图4. 非典病毒ORF3a(E171S R193W)突变体能够招募VPS39以及促进溶酶体外泌 

　　该研究揭示了新冠病毒的ORF3a促进溶酶体外泌。ORF3a能够招募在溶酶体外泌中起重要作用的分子，促进溶酶体向细胞膜方向运输并向细胞外分泌。非典病毒的ORF3a并不具有促进溶酶体外泌和阻滞细胞自噬的功能。这项研究对于理解新冠病毒和非典病毒传染性和致病性的差异，开发新的病毒治疗方法提供了帮助。同时对于新冠病毒的起源研究也有一定的意义。 

　　图5. 新冠病毒ORF3a促进溶酶体外泌的模式图 

　　该研究的通讯作者为中国科学院生物物理研究所的张宏研究员，第一作者为张宏组的博士后陈迪。该课题组主要从事多细胞生物自噬分子机制及生理功能的研究。 

   （来源：BioArt） 

　　参考文献： 

　　1. Ghosh, S., Dellibovi-Ragheb, T.A., Kerviel, A., Pak, E., Qiu, Q., Fisher, M., Takvorian, P.M., Bleck, C., Hsu, V.W., Fehr, A.R., et al. (2020). beta-Coronaviruses Use Lysosomes for Egress Instead of the Biosynthetic Secretory Pathway. Cell 183, 1520-1535.e14. 

　　2. Pu, J., Guardia, C.M., Keren-Kaplan, T., and Bonifacino, J.S. (2016). Mechanisms and functions of lysosome positioning. J. Cell Sci. 129, 4329-4339. 

　　3. Tancini, B., Buratta, S., Delo, F., Sagini, K., Chiaradia, E., Pellegrino, R.M., Emiliani, C., and Urbanelli, L. (2020). Lysosomal Exocytosis: The Extracellular Role of an Intracellular Organelle. Membranes 10:406. 

　　4. Shang, J., Wan, Y.S., Luo, C.M., Ye, G., Geng, Q.B., Auerbach, A., and Li, F. (2020). Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 117, 11727-11734. 

　　5. Hoffmann, M., Kleine-Weber, H., Schroeder, S., Kruger, N., Herrler, T., Erichsen, S., Schiergens, T.S., Herrler, G., Wu, N.H., Nitsche, A., et al. (2020b). SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell 181, 271-280.e8. 

　　6. Miao, G.Y., Zhao, H.Y., Li, Y., Ji, M.M., Chen, Y., Shi, Y., Bi, Y.H., Wang, P.H., and Zhang, H. (2021). ORF3a of the COVID-19 virus SARS-CoV-2 blocks HOPS complex-mediated assembly of the SNARE complex required for autolysosome formation. Dev. Cell 56, 427-442. 

　　7. Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., and Andrews, N.W. (1997). Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104. 

　　8. Medina, D.L., Fraldi, A., Bouche, V., Annunziata, F., Mansueto, G., Spampanato, C., Puri, C., Pignata, A., Martina, J.A., Sardiello, M., et al. (2011). Transcriptional Activation of Lysosomal Exocytosis Promotes Cellular Clearance. Dev. Cell 21, 421-430. 

　　链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1534580721008078