福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本是医学研究和临床病理诊断中不可或缺的生物资源库。这些样本能够长期保存组织形态和细胞细节，且携带完整的临床随访信息，为疾病机制研究、药物开发和精准医学提供了宝贵材料。然而，传统单细胞测序技术受限于FFPE样本的RNA交联、片段化及降解问题，难以实现高质量的单细胞分辨率分析。如何从这些“沉睡”的样本中解锁全转录组信息，一直是领域内的技术难题。

针对FFPE样本的固有挑战，良渚实验室王永成团队历时多年攻关，成功开发了snRandom-seq（Single-Nucleus Random-seq）技术。这一突破性方法通过整合随机引物捕获、原位反应优化和微流控液滴分选技术，实现了从FFPE样本中高效分离单细胞核并构建高质量转录组文库的目标。相关内容以“Single-nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded samples using snRandom-seq”为题发表在《Nature Protocols》上。 

snRandom-seq技术详解

snRandom-seq的核心优势在于其独特的实验设计和高效的样本处理流程：

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单细胞核分离

从FFPE样本中精准分离完整细胞核是测序的关键第一步。团队优化了组织消化和过滤流程，确保细胞核的高效提取（图1）。通过显微镜实时监测，避免过度消化导致的核碎片化，最终获得高纯度的单细胞核悬液。

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原位反应与随机引物捕获

图1：snRandom-seq原位反应流程

在细胞核内，利用随机引物和寡聚dT引物的混合策略，全面捕获mRNA和非编码RNA。独特的DNA阻断技术有效排除基因组DNA污染，而3'端加A尾处理则为后续建库奠定基础。

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微流控液滴建库

单细胞核与含条形码的微球在液滴中封装，通过延伸反应为每个细胞核赋予唯一标识。最终通过PCR扩增和测序文库构建，实现高通量单细胞转录组分析。

临床应用潜力

研究团队首次将snRandom-seq应用于肺癌和胶质瘤的FFPE样本分析，取得了突破性成果：

肺癌研究

结合成像质谱流式技术，揭示了原发灶与转移灶肿瘤微环境的异质性，发现了特定免疫微环境与免疫治疗响应的关联。

胶质瘤研究

在超过100例临床样本中，鉴定出胶质母细胞瘤的复发亚型特征，并检测到与预后相关的非编码RNA标志物。

技术优势与未来展望

与传统方法相比，snRandom-seq具有以下显著优势：

高灵敏度

兼容低质量RNA样本（DV200≥30%），减少样本损耗。

全转录本覆盖

同时捕获mRNA、非编码RNA及新生RNA，提供更全面的转录组信息。

低双联率

通过预索引策略将双联率控制在0.3%，提升数据可靠性。

未来，snRandom-seq有望扩展至更多疾病领域，如神经退行性疾病、自身免疫病等，为精准医学提供强大的工具支持。

该研究由良渚实验室王永成研究员指导，浙江大学附属第一医院徐子叶研究员、良渚实验室博士生吕乐筱、良渚实验室研究员陈海德为第一作者，研究获国家自然科学基金（No. 32271421）、浙江省领军创新团队计划（2021R52003）、中国航天员科研训练中心航天医学全国重点实验室研究基金（No. SKL2024K04 ）和中国载人航天工程航天医学实验领域项目（No. HYZHXMH03003）等资助。