作者：周建　任雪梅　王馨　李卓

（西安医学院第一附属医院检验科，陕西 西安 710077）

引用本文：周建，任雪梅，王馨，等. CRISPR/Cas核酸检测系统的研究进展和未来挑战[J]. 检验医学，2024，39（6）：608-614.

摘要

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（Cas）系统是一种新兴的分子诊断技术，具有检测速度快、操作简单、特异性高等优势，目前已成为分子诊断领域的研究热点。基于CRISPR/Cas系统构建的核酸检测系统中有一部分已得到临床验证，并获得预期的结果，有望成为一种理想的核酸分子诊断技术，但其在临床大规模应用前尚有一系列问题需要解决。文章对已建立的CRISPR/Cas核酸检测系统的原理、特点和存在的问题进行综述，以期为CRISPR/Cas核酸检测系统的临床应用提供依据。

关键词

成簇规律间隔短回文重复序列；成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白；分子诊断技术；核酸

目前，反复出现的各类传染性疾病对分子诊断技术而言是严峻的挑战。已有的分子诊断技术，如聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、数字PCR等具有特异性、灵敏度高等优点，但存在检测耗时长、成本较高、需要大量专业设备和检测人员，以及较难实现即时检测（point-of-care test，POCT）等不足。随着分子生物学技术的发展，有研究发现，成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein，Cas）系统不但可以用于基因编辑，还可以用于分子诊断，尤其在核酸分子诊断过程中具有检测速度快、设备便携、成本低廉等优点，因而被广泛关注。然而，CRISPR/Cas系统在前期的临床应用中也出现了一系列问题。为此，本文拟对基于CRISPR/Cas系统构建的核酸检测系统的原理、特点、存在的问题和解决思路、方向进行综述，以期为CRISPR/Cas核酸检测系统的推广应用提供参考。

一、CRISPR/Cas系统分类

1987年，CRISPR/Cas在细菌中被发现，但直到2000年才被命名。依据效应蛋白种类分为Class-Ⅰ和Class-Ⅱ 2个大类，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 6种类型，其中Class-Ⅱ类包括Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12/14、Ⅵ型的Cas13。2012年，JINEK等从链球菌中分离出spCas9蛋白，证明其具有识别和切割靶向DNA序列的能力。2015年，ZETSCHE等发现CRISPR/Cas12a（Cpf1）系统具有能识别双链DNA的核酸内切酶。随着研究的深入，CRISPR/Cas系统的成员也逐渐丰富，其生物学功能，如基因编辑、分子诊断等也逐渐被开发利用。

二、可应用于分子诊断的CRISPR/Cas类型

目前，可应用于分子诊断的CRISPR/Cas系统的主要类型有：Ⅱ型的代表CRISPR/Cas9、V型的代表CRISPR/Cas12/14和Ⅵ型的代表CRISPR/Cas13。CRISPR/Cas9系统中的引导RNA（guide RNA，gRNA）可引导Cas9蛋白识别目标DNA/RNA序列和原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM），激活Cas9对双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的切割能力。CRISPR/Cas12/14系统可靶向识别DNA并激活其靶向切割和非靶向切割DNA的能力。CRISPR/Cas13系统中的Cas13蛋白在gRNA的引导下，可识别靶向RNA序列，激活其靶向和非靶向切割RNA活性。目前，基于CRISPR/Cas系统的靶向识别以及特异性和非特异性切割核酸功能开发了一系列核酸检测系统，其检测策略见图1。

三、CRISPR/Cas核酸检测系统的构建策略

基于CRISPR/Cas系统构建核酸检测系统的主要策略是联合PCR、重组酶聚合酶等温扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等技术对靶向核酸序列进行体外扩增，此过程提高了检测的灵敏度，但增加了操作步骤、提高了被污染的风险。因此，尚需对核酸检测系统进行优化，建立一种无需扩增的CRISPR/Cas核酸检测系统。见图1。

3.1　基于CRISPR/Cas9构建的核酸检测系统

基于Cas9蛋白的靶向识别和切割能力，PARDEE等构建了依赖于LacZ开关和CRISPR/Cas9的核酸检测系统——NASBA检测系统，该检测系统的原理是通过CRISPR/Cas9靶向开启或关闭LacZ基因的表达来实现核酸检测，其检测结果采用纸片传感器读取，可在3 h内完成美洲寨卡病毒和非洲寨卡病毒的鉴定，实现了检测结果的可视化读取。其基本原理见图1（a）。CRISPR/Cas9联合电极芯片构建的CRISPR-Chip检测平台是利用dCas9蛋白（指具有识别dsDNA的能力但是无切割dsDNA的活性的蛋白）高特异性靶向识别能力建立的检测系统，可区分单碱基，已成功应用于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）检测，其基本原理见图1（b）。CRISPR/Cas9联合PCR构建的成簇规律间隔短回文重复序列分型聚合酶链反应（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-typing polymerase chain reaction，ctPCR）是一种基于配对Cas9建立的核酸检测系统，具有检测耗时长和操作复杂等不足。因此，ZHANG等将CRISPR/Cas9系统与定量PCR联合，建立了ctPCR3.0系统，缩短了检测时间，提高了检测效率。Cas9n是HNH位点酶切功能失活，且具有切割dsDNA中1条链的能力的Cas9蛋白。ZHOU等基于pair Cas9n构建了配对CRISPR/Cas9n开启的核酸内切酶介导的链置换核酸扩增（CRISPR/Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplification，CRISDA）技术，已成功应用于SNP检测。基于配对Cas9构建的核酸检测系统的识别靶点为双靶点，极大地提高了检测的特异性，但也增加了反应体系的复杂程度。总之，基于CRISPR/Cas9建立的核酸检测系统可实现在30 min内完成核酸检测，检测下限可达fmol·L^-1水平，且能可视化读取结果。

3.2　基于CRISPR/Cas12构建的核酸检测系统

3.2.1　基于荧光信号的Cas12核酸检测系统

基于Cas12a建立的低成本高效的核酸检测系统（one-hour low-cost multipurpose highly efficient system，HOLMES）将CRISPR/Cas12a系统与PCR技术联合，采用Cas12a识别靶向序列后非靶向切割荧光标记的ssDNA，产生荧光信号并进行检测，但其需要2步才能完成检测，易造成交叉污染；该系统目前已被用于检测乙型脑炎病毒和DNA甲基化。鉴于HOLMES存在的不足，因此LI等开发了HOLMESv2检测系统，该系统将Cas12b与LAMP技术联合，实现了DNA扩增和Cas12b检测的一步法，简化了操作步骤，避免污染。SUN等建立了一步法DNA内切酶靶向CRISPR反式报告基因检测系统，可在50 min内完成H1N1甲型流感病毒的检测，检测下限可达1 拷贝·μL^-1。MUKAMA等将CRISPR/Cas12a/b与LAMP技术和侧流生物传感器联合建立核酸检测平台，采用CRISPR/Cas12a/b识别靶向区域后，切割荧光标记非靶向序列，并产生荧光信号，采用侧流生物传感器读取信号，可在50 min内完成铜绿假单胞菌核酸的检测，检测下限为1 拷贝·μL^-1。TENG等将CRISPR/Cas12b与RPA技术联合后构建的荧光信号核酸检测系统对血浆人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA的检测下限可达1 amol·L^-1。WANG等基于Cas12a构建的可视化荧光信号检测平台（Cas12a-based visual detection，Cas12aVDet）操作步骤少，显著降低了污染的发生率，可在30 min内完成支原体的检测，并实现了检测结果的可视化读取。基于LAMP-CRISPR/Cas12a的核酸检测平台实现了在紫外线灯下检测大肠埃希菌核酸，且结果可视化。基于CRISPR/Cas12侧流生物传感器（CRISPR/Cas12 lateral flow biosensor，CRISPR/Cas-LFB）制备的试纸条可在2 h内完成非洲猪瘟病毒DNA的检测，检测下限可达1 fmol·L^-1。基于CRISPR/Cas12构建的荧光信号核酸检测系统极大地提高了检测灵敏度，缩减了检测步骤，降低了污染率，尤其是CRISPR/Cas-LFB、Cas12aVDet等核酸检测系统实现了可视化和POCT检测，具有极大的推广潜力。

3.2.2　基于电化学信号的Cas12a核酸检测系统

DAI等构建了基于CRISPR/Cas12a的电化学生物传感器（CRISPR/Cas12a-based electrochemical biosensor，E-CRISPR）核酸检测系统，他们将标记有亚甲蓝的非特异性ssDNA固定在金电极上，在gRNA的引导下，Cas12a识别靶向序列并非特异性切割固定在金电极上的ssDNA报告基因，引起电极芯片电信号的变化，实现目的基因的检测。E-CRISPR核酸检测系统可在30 min内完成HPV和转化生长因子-β1等的检测。LIU等构建了基于电化学发光信号（electrochemiluminescence，ECL）的核酸检测系统，该系统利用Cas12a识别靶向序列后非靶向切割固定在载体上的金标记的ssDNA复合体（SH-ssDNA-Fc/MetAuNC），从而产生电化学信号的变化，可在70 min内完成HPV检测，检测下限为0.48 pmol·L^-1。ECL核酸检测系统将CRISPR/Cas12系统与电化学技术结合，提高了检测灵敏度，为CRISPR/Cas12系统的临床应用提供了一种新的思路。

3.2.3　基于商品化早孕试纸的CRISPR/Cas12a核酸检测系统

TANG等将商品化早孕试纸与CRISPR/Cas12a系统联合建立核酸检测系统，主要部件包括Cas12a、菜花状大型DNA组合体（cauliflower-like large-sized DNA assembly，CLD）、RPA、ssDNA-人绒毛膜促性腺激素结合探针（human chorionic gonadotropin conjugation probe，NHP）。基本检测流程为RPA扩增目标DNA，gRNA引导Cas12a识别靶向序列并非靶向切割NHP序列后，与早孕试纸结合、显色，可在30 min内完成HPV核酸检测，检测下限为2 拷贝·μL^-1。

总之，将CRISPR/Cas12系统与荧光信号、电化学信号和商品化试纸条结合，极大提高了检测效率，简化了操作，降低了检测成本，尤其是与电化学技术结合有效提高了检测的灵敏度。然而，基于CRISPR/Cas12建立的核酸检测系统也存在不足，如Cas12的脱靶效应、需要扩增技术辅助等，这也限制了其商业化应用。

3.3　基于CRISPR/Cas14的核酸检测系统

CRISPR/Cas14具有对非靶向DNA的切割能力，基于这一特点，HARRINGTON等开发了Cas14-DETECTR核酸检测系统，其基本流程为：对硫代磷酸标记5'引物对靶向区域进行体外扩增，获得dsDNA后，采用T7核酸外切酶从5'到3'降解dsDNA或RNA、DNA中的一条链，获得ssDNA，然后Cas14在gRNA的引导下，识别靶向序列并非靶向切割荧光标记ssDNA，产生荧光信号，该系统可在2 h内完成检测下限达1 amol·L^-1水平的SNP检测。CRISPR/Cas14是一类新型核酸酶，代表了一种新的检测系统。

3.4　基于CRISPR/Cas13的核酸检测系统

CRISPR\Cas13系统具有靶向切割RNA和非特异切割RNA的活性，因此学者们基于此特性建立了一系列核酸检测系统，其基本原理见图1（d）。基于CRISPR/Cas13建立的核酸检测系统的直接检测靶标为RNA序列，其检测靶标多样，实现了多通道检测，拓展了检测的样本类型，提高了临床实用性。另外，CRISPR/Cas13可与电化学技术、手机软件等结合，简化了信号读取方式，方便操作。然而，CRISPR/Cas13直接识别的靶标为RNA，因此部分核酸检测系统为了提高检测的灵敏度，需要借助转录和逆转录技术实现RNA和DNA的转化后再进行体外扩增，这增加了检测的复杂性。

3.4.1　基于CRISPR/Cas13的单通道荧光信号核酸检测系统

GOOTENBERG等基于CRISPR/Cas13a建立了单通道荧光信号检测系统，即特异性高灵敏度酶解报告基因解锁（specific high-sensitivity enzymatic reporter unLOCKing，SHERLOCK）检测系统，其由CRISPR/LwCas13a、RPA、逆转录技术和T7启动子转录技术构成。SHERLOCK检测系统利用Cas13a识别靶向ssRNA，并非特异性切割荧光素标记的ssRNA，产生荧光信号，可在2～5 h内完成寨卡病毒和登革热病毒检测，检测下限可达1 amol·L^-1。QING等将SHERLOCK系统与1种名为HUDSON的系统结合并建立核酸检测平台，采用37～50 ℃加热5～20 min灭活核酸酶，64～95 ℃加热5 min灭活病毒，一步法完成核酸检测，可在2 h内完成寨卡病毒核酸的检测，极大地缩短了检测时间，减少了操作步骤，降低了被污染率。LIU等将CRISPR/LbuCas13a与Csm6 RNA内切酶结合建立了增强荧光信号的快速串联集成核酸酶检测（fast integrated nuclease detection in tandem，FIND-IT）平台，并基于FIND-IT平台建立了快速检测新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）核酸的方法，检测时间为20 min，检测下限为31拷贝·μL^-1，无需进行核扩增。

3.4.2　基于CRISPR/Cas13的多通道荧光信号核酸检测系统

基于CRISPR/Cas12系统和CRISPR/Cas13系统建立的4通道核酸检测系统（SHERLOCKv2），是SHERLOCK检测系统的优化升级版，采用waCas13a、CcaCas13b、PsmCas13b和AsCas12a4 种酶实现了4 通道检测， 其显著提高了SHERLOCK系统的特异性，改善了结果读取的局限性。Csm6与Cas13耦联具有荧光信号放大的作用，可提高检测的灵敏度。SHERLOCKv2检测系统可在0.5～3 h内完成寨卡病毒、金黄色葡萄球菌等的检测。ACKERMAN等将CRISPR/Cas13a系统与PCR、RPA和微阵列芯片结合，开发了高通量病毒核酸检测平台——CARMEN/Cas13a，采用荧光成像系统记录荧光信号，具有高通量、快速、低成本的优点，一次可检测169种与人类相关的病毒核酸，检测下限可达1 amol·L^-1。CARMEN/Cas13a检测平台实现了多通道样本检测，显著提高了检测效率。

3.4.3　基于CRISPR/Cas13的电化学信号核酸检测系统

ZHOU等将CARMEN/Cas13a与催化循环DNA发夹结构结合，建立了基于电化学信号检测的电化学RNA传感技术芯片（COMETchip），可在36 min内完成miRNA的检测，检测下限为50 amol·L^-1。FOZOUNI等将化学发光技术与CARMEN/Cas13a结合，将核酸分子信号通过Cas13a转化为电化学信号，构建了基于特异性引物的电化学信号miRNA检测平台——PECL-CRISPR，可在30 min内完成检测，检测下限可达1 fmol·L^-1。

3.4.4　基于手机读取信号的CRISPR/Cas13核酸检测系统

ARIZTI-SANZ等将CRISPR/LbuCas13a与手机显微镜技术结合，采用buCas13a识别靶向序列并非靶向切割荧光标记核酸序列，从而产生荧光信号，采用手机显微镜检测系统读取荧光信号进行检测。该核酸检测系统具有快速、成本低廉等特点，且不需要进行核酸扩增。NGUYEN等建立了名为SHINE的核酸检测系统，采用HUDSON系统灭活SARS-Cov-2 10 min，在同一个反应体系中完成反应，5 min内用手机APP软件读取荧光信号，敏感性为90%，特异性为100%，平均反应时间为50 min。

四、CRISPR/Cas核酸检测系统的特点和未来面临的挑战

4.1　样本前处理问题

基于CRISPR/Cas构建的核酸检测系统中有少数检测系统将样本前处理与核酸检测过程合并，虽然解决了样本处理的问题，但仍存在核酸纯度低，导致检测效率低的不足。为了提高检测效率，大部分CRISPR/Cas核酸检测系统将样本处理和检测过程分为两步完成，首先采用传统方法提纯核酸，然后采用CRISPR/Cas核酸检测系统进行靶标检测，此策略增加了操作步骤，亦增加了污染的风险。因此，CRISPR/Cas核酸检测系统未来面临的挑战之一是优化样本前期处理流程，实现样本处理与检测过程的合并（图1）。

4.2　CRISPR/Cas系统与辅助技术的联合问题

在基于CRISPR/Cas的核酸检测过程中，为了实现对DNA和RNA靶标检测的灵活性，必须借助于转录技术和逆转录实现DNA与RNA的转化；同时，为了提高检测的灵敏度，需借助PCR、RPA和LAMP等辅助技术对目标序列进行扩增，以提高靶向核酸序列的浓度。然而，联合辅助技术检测显著增加了检测成本、检测时长和操作步骤等。基于CRISPR/Cas的核酸检测过程存在一个关键难题，一步法CRISPR/Cas核酸检测系统操作步骤少，可有效减少污染，但核酸扩增和CRISPR/Cas在同一个反应体系中，扩增底物模板为CRISPR/Cas识别和切割的靶向序列，在扩增过程中CRISPR/Cas会同时切割模板序列，导致扩增模板损失，影响了扩增效率，尤其是CRISPR/Cas12检测系统可非特异性切割扩增引物，从而抑制扩增，极大地影响了扩增效率。两步法CRISPR/Cas核酸检测系统虽能有效解决以上问题，但却增加了操作步骤和被污染的风险。因此，一步法和两步法各有弊端，还有待优化检测策略，其中最优化的方案见图1，期望在未来的研究中能解决一步法和两步法CRISPR/Cas核酸检测系统面临的问题。

4.3　CRISPR/Cas核酸检测系统的通量问题

随着分子生物学技术的不断发展，CRISPR/Cas系统迎来了新的挑战，其中之一就是通量问题。目前，临床需要检测的靶标分子种类和数量越来越多，如何提高检测通量是CRISPR/Cas系统未来面临的挑战之一。虽然CARMEN/Cas13a平台可一次性检测169种与人类相关的病毒基因，但该平台未经大样本量的临床验证，且操作复杂，检测成本高，尚无法应用于临床。因此，CRISPR/Cas核酸检测系统需进一步优化，提高检测通量和检测效率，并进行大规模临床验证，这也是CRISPR/Cas核酸检测系统未来需要解决的重要问题。

4.4　CRISPR/Cas核酸检测系统的信号读取问题

随着临床诊断要求的不断提高，需要检测的靶标分子种类不断增多，因此需建立更丰富的针对不同靶标的CRISPR/Cas核酸检测系统，以满足临床对复杂样本靶标检测的需求。目前，CRISPR/Cas核酸检测系统的信号读取方式也在不断改进，如荧光信号、电化学信号、侧流生物传感器、商业品化试纸条，极大地改善了传统单一的信号读取方式。见图2。

4.5　Cas蛋白的脱靶效应问题

CRISPR/Cas系统的脱靶效应会导致检测结果出现假阳性，在未来的研究中需优化CRISPR/Cas系统，降低其脱靶效应，以降低检测结果的假阳性。这也是CRISPR/Cas系统未来面临的挑战之一，其解决策略包括：1）寻找获得高保真的Cas蛋白，优化gRNA序列，优化反应体系温度以及Cas蛋白和gRNA的比例，尽量降低脱靶效应；2）CRISPR/Cas识别靶点序列依赖于PAM，这限制了检测靶标的灵活性，因此需寻找无PAM限制的Cas蛋白，以提高检测靶标的灵活性。

五、总结与展望

CRISPR/Cas系统作为一种新兴的核酸检测方法具有很大的发展潜力，其在病原体核酸检测方面表现出色，一定程度上可以弥补传统核酸检测方法的不足，有望成为理想的分子诊断方法。不同CRISPR/Cas核酸检测系统的特点见表1，CRISPR/Cas系统与传统PCR的比较见表2。然而，CRISPR/Cas系统本身也存在一定的不足，如脱靶效应和检测靶标的灵活性不足。同时，CRISPR/Cas核酸检测系统也处于难以商品化的困境：1）一步法检测效率较低，两步法虽然提高了检测的灵敏度，但也增加了操作的复杂性，增加了污染的风险；2）缺少高效的高通量检测系统和临床大规模的验证。这也是CRISPR/Cas核酸检测系统商品化亟待解决的问题。另外，将CRISPR/Cas核酸检测系统与人工智能联合可以显著提高检测效率，实现可视化的POCT检测，更好地服务于临床。

参考文献（略）