主 要 简 介

血液外泌体正在成为诊断阿尔茨海默病（AD）等脑部疾病的潜在生物标志物。目前缺乏一种超灵敏的技术来识别血液外泌体中的核心AD生物标志物，以优化生物标志物在临床实践中的效用。在这里，使用DNA偶联抗体开发了一种免疫磁性外泌体聚合酶链反应（iMEP）平台，用于快速检测临床血液外泌体中的淀粉样蛋白β（aβ_1–40和aβ_1–42）和磷酸化tau（p-tau ^396，404和p-tau¹⁸¹）。Toehold位移介导的DNA亲和力下拉消除了高检测背景，允许检测浓度低至每毫升10飞克的生物标志物。在iMEP检测中，与外泌体p-tau¹⁸¹和p-tau^396，404相比，外泌体aβ_1–42在区分AD患者和健康个体方面更准确，灵敏度为95.0%，特异性为95.0%。iMEP技术还擅长量化与疾病发病相关的不同外体生物标志物的水平。

【本文研究的意义】

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经系统疾病，其病理过程涉及Aβ斑块（A）、tau缠结（T）和进行性神经退行性（N）的聚集。此外，它们结合的ATN框架允许对AD进行诊断和分期。AD的临床评估现在越来越依赖于神经病理学验证的生物标志物Aβ和tau。美国食品药品监督管理局批准了神经影像学和CSF生物标志物在AD早期诊断中的应用，但它们的高成本、有限的可及性和侵入性限制了它们作为首选AD诊断工具的使用。使用基于血液的生物标志物可以实现低成本、广泛可用和无创的AD早期诊断，因此，通过血液测试进行AD筛查将是迈向早期干预、减轻社会负担的重要一步。

尽管已报道血浆神经元外泌体可作为AD的生物标志物，但缺乏特定的分离和提取方法限制了对神经元外泌体的基础研究和临床应用。这可能是因为血液外泌体的异质性以及在高灵敏度下检测血液外泌体中生物标志物的困难。在此，研究人员描述了一种敏感的检测平台，称为免疫磁性外泌体聚合酶链反应（iMEP），用于快速检测核心AD生物标志物（Aβ_1–42、Aβ_1–40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹）（图1），该平台实现了对血液外泌体的富集和多个血液生物标志物的敏感检测。

iMEP系统整合了血液外泌体的免疫磁性富集、外泌体上生物标志物的免疫识别和实时PCR。在该系统中，研究人员采用了拓展置换介导的DNA亲和富集，将富集的外泌体结合抗体的DNA-抗体偶联物纯化步骤。考虑到夹心ELISA的特异性和PCR信号放大的结合，与富集的外泌体结合抗体的DNA偶联物的iMEP能够可靠地检测到浓度低至10 fg/ml的目标分子。该方法可以选择性地鉴定血液外泌体中的各种与AD相关的生物标志物，并通过估算血液外泌体中AD生物标志物的水平区分临床诊断为AD的患者与健康个体。

主要内容

1、基于血液外泌体的iMEP检测的实现

图2A总结了iMEP检测抗原的工作原理，该方法是通过磁珠富集结合DNA-抗体共轭物来实现的。首先以Aβ1–42肽为例；将抗Aβ1–42初级抗体（1F12）修饰在涂覆的磁珠上，采用双抗体夹心和核酸分子嵌合物的方法。与Aβ1–42结合后进行磁性分离，然后引入抗Aβ1–42次级抗体-DNA共轭物（DNA-2C6），构建了使用1F12共轭磁珠和DNA-2C6共轭物的双抗体夹心免疫测定平台。随后通过ELISA验证了抗Aβ1–42抗体的特异性和结合亲和性（图2B），发现该抗体对目标具有很强的选择性特异性和高结合亲和力，抗体和抗原之间的平衡解离常数（Kd）约为10。

CD63是一种经典的四跨膜标记，在各种外泌体表面高度表达。因此，生物素化的CD63抗体能够有效捕获和积累CD63标记的外泌体。因此在该实验中，使用了生物素化的CD63抗体和抗生物素阳性磁珠对血液外泌体进行简单富集。血液外泌体的透射电镜（TEM）图像显示了囊泡结构（图2C），其大小范围为90至200 nm（图2D）。同时，为了确定iMEP系统是否正确识别了外泌体中的Aβ，进行了与AuNP结合的抗Aβ1–42抗体的囊泡的TEM，图2E的结果表明了外泌体成功与Aβ1–42蛋白进行了结合。

随后，研究人员评估了iMEP在不同检测环境中定量检测生物标志物的能力。在200倍（0.5%）稀释的全血、血浆和外泌体中测试了一系列稀释梯度的Aβ1–42样品。结果显示，随着Aβ1–42浓度的增加，实时荧光曲线清晰地显示出放大和较短的循环阈值（Ct）值。之后通过阈值分析，比较了全血、血浆和外泌体稀释中的检测灵敏度，发现外泌体稀释环境中检测背景值最低。将样品与背景之间的ΔCt值与Aβ1–42浓度绘制在一起后，发现随着Aβ1–42浓度的增加，ΔCt值呈线性增加（图2，F至H）。同时计算得出，iMEP在全血样品中的最低检测浓度为0.1 pg/ml，进一步证明DNA-抗体实时PCR可直接应用于全血、血浆和外泌体中低丰度生物标志物的检测。总的来说，iMEP检测平台在外泌体样品中显示出最低的背景信号。该iMEP检测方法在临床样本中的检测限为100 fg/ml，考虑到外泌体中AD生物标志物的浓度（5至200 pg/ml），该iMEP平台完全可以满足临床样本的检测限制。

2、合成的Aβ_1-42多肽检测iMEP的敏感性

传统免疫-PCR技术的最突出缺点是PCR的高背景信号，这种干扰的主要原因包括DNA和DNA-抗体共轭物中的过量抗体。过量抗体的非特异性结合到固相载体上可能会影响免疫测定结果，并且通过PCR可以放大这种背景信号。

为了进一步改善非特异信号并提高iMEP的重现性，第一步是设计DNA-抗体共轭物的纯化过程。如图3A所示，toehold位移介导的DNA亲和力在纯化步骤中去除了过量未结合的抗体。因此，抗原可以与尽可能多的DNA-抗体共轭物结合，从而提高了测定的灵敏度和准确性。随后使用DNA-抗体实时PCR检测系统比较了DNA-抗体共轭物纯化前后检测到的背景信号和灵敏度的差异。通过将Aβ_1–42肽（100 pg/ml）添加到阳性组的稀释血清中，发现纯化后的荧光信号比纯化前增加了1.3倍，对应的ΔCt值差异为2.3（图3B），表明纯化组的信号更敏感。并且如图3C所示，每个循环都监测了归一化的报告信号（Rn）的增加，并且使用了前7.5个循环作为背景信号进行基线校正。鉴于Ct值与DNA模板量成反比，因此也与抗原浓度成反比。所以在图3C中，起始模板浓度越高，就越早观察到荧光增强，但Ct值越小。实验也发现，Aβ_1–42浓度（x）和ΔCt值（y，定义为每个Aβ_1–42浓度与没有Aβ_1–42的控制免疫球蛋白G（IgG）（即背景）之间的Ct差异）之间有强线性关系，其动态范围横跨了七个数量级（线性方程为y = 0.689x + 1.41（R2 = 0.99）），iMEP测定的检测限（LOD）确定为10 fg/ml（图3D）。接下来，研究人员进行了传统ELISA双抗体夹心法测定，用于测量上述范围内七个数量级的Aβ_1–42，并且在10至105 pg/ml的范围内观察到了Aβ_1–42浓度（x）和450 nm处的光密度（OD450）值（y）之间的线性相关性（图3E），其方程为y = 6.89 × ln（x+ 907060.18）– 94.3（R² = 0.954）。Aβ_1–42夹心ELISA检测的检测限为10 pg/ml，比iMEP达到的LOD高了103倍（图3F）。这些结果证明了iMEP检测的高灵敏度和定量能力。

3、iMEP对Aβ_1-42在血浆和血液外泌体中的作用

为了验证iMEP在真实样本中的有效性，使用了C57BL/6和5×FAD转基因小鼠的血浆和血液外泌体样本。结果显示，在C57BL/6和5×FAD小鼠的血浆中检测到了Aβ_1–42（图4，A至C）。同时实验收集了血浆样本（n = 20）进行双抗体夹心ELISA，通过计算，在5×FAD小鼠和C57BL/6对照组之间观察到Aβ_1–42水平的显著差异（P = 0.0011，未配对t检验）。随后通过双抗体夹心ELISA检测了C57BL/6和5×FAD小鼠外泌体（n = 20）中的Aβ_1–42水平（图4，D至F），实验基于夹心ELISA调查了20个独立的血液外泌体样本，并且也在5×FAD小鼠和C57BL/6对照组之间观察到Aβ_1–42水平的显著差异（P = 0.0002，未配对t检验）。特别是，如图4（G至I）所示，iMEP在5×FAD小鼠和C57BL/6对照组之间检测到外泌体Aβ_1–42水平的差异非常显著（P < 0.0001，未配对t检验）。对通过ELISA测量的血浆中Aβ_1–42水平（血浆-ELISA）和通过ELISA测量的外泌体中Aβ_1–42水平（外泌体-ELISA）进行的受试者工作特征（ROC）曲线的差异分析（图4，J和K）进一步证明了iMEP检测方法的优异检测灵敏度，有利于AD的诊断和分析。

4、单个血液样本中多个生物标志物的临床检测

由于血液外泌体含有来源于不同细胞类型（如神经元、星形胶质细胞和胶质细胞）和组织的各种外泌体，因此它们可能更有潜力反映AD进展中生物标志物的变化水平。为了进一步证明iMEP检测外泌体中Aβ水平的优越性，研究人员使用iMEP检测方法比较了血液神经元源性外泌体与健康个体和AD患者血液外泌体中AD生物标志物的差异水平。如图5A所示，通过免疫亲和捕获，两种类型的外泌体，血液外泌体（CD63⁺外泌体）和神经元源性外泌体（神经细胞黏附分子-阳性（NCAM⁺）外泌体），被富集。研究发现，用于区分健康个体和AD患者的AD生物标志物水平在血液外泌体中差异更显著（n = 10）。在血液外泌体中检测到的与AD生物标志物相对应的ΔCt值通常高于在神经元源性外泌体中检测到的ΔCt值（图5，B至E）；也就是说，在血液外泌体中检测到的AD生物标志物水平更高。此外，研究观察到在健康个体和AD患者的血液外泌体中Aβ1–40水平存在显著差异，而在神经元源性外泌体中，健康个体和AD患者的Aβ_1–40水平相近。这些结果表明，血液外泌体能够比神经元源性外泌体更好地区分健康个体和AD患者。

为了评估iMEP的临床适用性，研究人员比较了iMEP检测与夹心ELISA检测临床样本中血浆AD生物标志物的敏感性。利用iMEP系统，在40个独立的临床血液外泌体样本中测量了Aβ_1–42、Aβ_1–40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹水平，并对每个样本的ΔCt值进行了统计分析（n = 40，图6，A至D）。如图6E所示，在AD患者和健康个体之间血液外泌体Aβ_1–42水平存在显著差异（P < 0.0001，未配对t检验）。此外，也利用夹心ELISA检测了血液和外泌体样本中Aβ_1–42的水平。结果表明，与健康个体相比，AD患者的血液和外泌体样本中Aβ_1–42水平较高。然而，在血浆和外泌体样本中使用夹心ELISA未检测到Aβ_1–42的水平差异。未配对t检验的差异分析显示，iMEP的检测敏感性显著高于夹心ELISA，P值接近0.0002。作为参考，使用Aβ-PET、CSF p-tau¹⁸¹和蒙特利尔认知评估来评估AD的不同疾病阶段的临床诊断。在AD患者和健康个体之间的血液外泌体Aβ_1–40水平存在显著差异（图6F；P = 0.0003，未配对t检验）。此外，血液外泌体中p-tau^396,404（图6G；P < 0.0001，未配对t检验）和p-tau¹⁸¹水平（P = 0.0003，图6H）在AD患者和健康个体之间也存在显著差异。然而，血液外泌体中p-tau^396,404的差异水平比p-tau¹⁸¹更显著，表明使用血液外泌体中的p-tau^396,404作为预测因子可以更准确地区分AD患者和健康个体。接下来，对应于iMEP、外泌体-ELISA和血浆-ELISA的ROC曲线显示，它们的ROC曲线下面积（AUC）值分别为0.993、0.769和0.613（图6I）。同时也对血液外泌体中Aβ_1–42的水平在AD的不同阶段进行了测量（图6J），结果显示血液外泌体中Aβ_1–42的浓度逐渐增加，与AD疾病的进展呈正相关。与健康个体相比，轻度至中度和严重AD患者的血液外泌体Aβ_1–42浓度显著更高[P < 0.0001，单因素方差分析（ANOVA）]。

接下来，进一步调查了每个生物标志物的AUC值。ROC分析是一种用于评估检测灵敏性、特异性和准确性的标准统计方法。AUC值量化了检测方法的诊断准确性，值为1.0表示完美的临床预测。分析结果显示，Aβ_1–42和p-tau^396,404的估计AUC值超过了0.95，而Aβ_1–40和p-tau¹⁸¹的估计AUC值分别为0.85和0.79（图6K）。表明，作为预测因子的单一生物标志物Aβ_1–42能够以95.0%的灵敏度和95.0%的特异性成功区分AD患者和健康个体。当使用Aβ_1–40、p-tau^396,404或p-tau¹⁸¹作为单一预测因子时，仍然能够成功区分AD患者和健康个体，其平均灵敏度和特异性分别为81.7%和80.0%。

总结

1. 该文章基于免疫富集的外泌体和生物标志物特异性抗体-DNA结合物的组合，开发出了一种能够实时量化生物标志物含量的外泌体生物标志物检测平台iMEP，该平台在飞摩尔水平浓度下具有低背景信号、高特异性和高灵敏度的独特优势。

2. 通过分析不同检测环境（全血、血浆和外泌体）中Aβ_1–42肽的一系列浓度，发现外泌体环境中的信号背景最低。此外，iMEP在检测临床血液外泌体中的生物标志物方面显示出比检测临床血浆中更高的灵敏度。

3. iMEP反应系统相较于传统免疫PCR中高背景信号的显著减少，可以归因于在纯化步骤中使用了一种toehold shift介导的DNA亲和拉下方法来去除多余的未结合抗体。该系统与商业化的夹心ELISA相比，iMEP的检测灵敏度提高了1000倍。

4. iMEP平台可以在临床血液外泌体样本中精确量化Aβ_1–42、Aβ_1–40、p-tau^396,404和p-tau¹⁸¹等多个生物标志物。并且证明了：（i）低丰度的血液外泌体生物标志物Aβ_1–42和p-tau可能用于AD的诊断；（ii）外泌体Aβ_1–42对于AD的检测比外泌体p-tau¹⁸¹和p-tau^396,404更有效；（iii）iMEP可以精确量化外泌体上的多个靶标。

Hu, S., Zhang, L., Su, Y., Liang, X., Yang, J., Luo, Q., & Luo, H. (2024). Sensitive detection of multiple blood biomarkers via immunomagnetic exosomal PCR for the diagnosis of Alzheimer's disease. Science advances, 10(13), eabm3088. doi:10.1126/sciadv.abm3088