五、反应环境

1．阻断剂

阻断剂（blocker），是一类能应用于在体外诊断试剂开发过程中，以达到减少来自患者样本中的蛋白质干扰或者试验过程中的其他因素影响并由此可能造成的假阳性，假阴性的错误检测结果的物料的统称。

    众所周知，对于所有的用于体外诊断试剂开发的方法有几个参数是决定检测方法性能的关键：（1）固相材料的选择（2）抗体/抗原的选择（3）阻断剂的选择。为了生产出高灵敏度和高特异性的试剂，最关键的因素是选择具有与靶分子的高特异性结合的抗体或抗原。实际试验过程中，正确地使用阻断剂也有助于提高检测的灵敏度和特异性。这些阻断剂的使用可以有效地减少非特异性结合以增加信噪比，提高诊断试剂的临床使用性能。

    在免疫学检测试验中非特异性结合可发生于（1）固相材料和非目标的蛋白质结合 （2）患者的样品中存在的内源性抗体和检测试剂内抗体的结合。为了防止非特异性结合，要求在体外诊断试剂研发生产过程中要在固相材料包被之后使用阻断缓冲剂中以封闭固相材料上任何剩余未结合的位点，同时在准备检测样本的过程中使用其他的阻断剂以防止内源性干扰抗体与检测试剂组分抗体结合。

（1）用于固相材料阻断的封闭剂缓冲液

固相的定量免疫学测定方法，如酶联免疫吸附，横向免疫层析，以及免疫印迹均涉及抗体通过共价结合包被到固相材料的表面上这一过程。固相材料表面其他蛋白质或生物分子的非特异性结合可以减少检测的特异性和灵敏度。由此而专门设计的固相材料封闭剂是用以饱和固相材料的表面上未被抗体包被的结合位点以防止其他物质的非特异性结合从而提高试剂的灵敏度。

    开发一种新的免疫检测试剂，通常第一步就是优化抗原或捕获抗体在固相材料上的包被条件以期最大限度地把有效蛋白包被到固相材料表面。包被之后，固相材料表面任何剩余的未占据的结合位点必须被封闭以防止非特异性物质的结合。一个理想的封闭剂通常为蛋白质，因为它能够有效地封闭固相材料表面疏水性和亲水性位点。此外，它可以作为一种稳定剂用以防止蛋白在与固相材料的表面反应时发生变性。封闭剂的用量和使用时间必须根据不同的检测方法进行优化。封闭剂的用量不足会导致背景信号过高，减小信噪比，而使用浓度过高的封闭剂则可能掩盖抗体-抗原相互作用，也可引起信噪比的减小。

从以下图中可以很清晰的看到使用固相封闭缓冲液的效果：

 理想的固相封闭剂应该具有以下特征：

 ? 有效地阻断测定反应物非特异性结合到固体材料表面

 ? 不影响已包被到固体材料表面的试剂有效成分

 ? 可以起到试剂有效成分在固相表面稳定剂（防止变性）的作用

 ? 不与其它试剂有效成分发生交叉反应

 ? 不具有酶活性并由此可能与试剂中的底物反应而使信号加强或降解试剂中的反应物

 ? 批间差异小

    （2）能够阻断试验过程中出现的干扰的被动阻断剂和主动阻断剂

   免疫检测干扰是一类会引起检测结果假阳性或假阴性现象的泛指，潜在的干扰因素包括内源性抗体或病人样本中的其它结合蛋白，多反应抗体，自身抗体（嗜异性抗体）和人抗动物抗体。

   在免疫检测时，干扰物可通过非特异性结合来干扰抗体和分析物之间的反应，一方面抑制目标分析物与检测抗体的结合，产生假阴性，另一方面又可以在缺少目标分析物的情况下与捕获和检测抗体结合，从而产生假阳性。

     容易受到干扰的检测包括双抗体夹心抗原检测，竞争性检测和IgM捕获检测。文献中报道过的典型的例子包括对ToRCH，CEA，CA-125，CK-MB，LH，FSH，prolactin，TSH，AFP，cardiac troponin I (cTnI)和HCG等的检测。常见的能引起双抗体夹心检测抗原和竞争法检测偏差的主要是异嗜性抗体（HA）的干扰，HA是一类结合力弱的天然抗体，可与来自不同物种的免疫球蛋白反应，这些物种包括小鼠，山羊，兔子，绵羊和鸡。在诊断检测中，HA可以结合多种类型的无关抗原，从而干扰抗原—抗体的特异性结合反应。人抗小鼠抗体（HAMA）的干扰是HA干扰的一种类型，它可以特异性的结合小鼠抗体。因为小鼠单克隆在免疫检测的商业诊断中应用非常广泛，所以HAMA的干扰经常会遇到。例如人自身抗体类风湿因子（RF），可以与人自身的免疫球蛋白（IG）结合，同时也可以与动物免疫球蛋白交叉反应，可引起与HA/HAMA干扰类似的RF干扰。通常同种型（Fc 区域）特异性的HA干扰比异种型（Fab或结合位点）特异性的HA更普遍。

   为了阻断以上干扰因素在试验过程中的影响，实际体外诊断试剂研发生产使用的阻断剂通常分为被动阻断剂和主动阻断剂两种，一般较为常用的其他动物IgG，属于被动阻断剂，其工作原理是通过干扰抗体和捕获物的结合，提供可选结合位点来检测抗体。动物IgG（例如羊IgG）只能封闭一种类型的干扰物（例如人抗山羊抗体），因此通常选用不止一种类型的IgG，这取决于捕获和检测抗体的性质。在实际试验过程中，应该过量添加动物IgG，有效性取决于动物IgG对干扰抗体的亲和力。

在双鼠抗夹心法试验中，需要使用特异性阻断剂来除去特定类型的异嗜性抗体HA干扰，异嗜性抗体HA干扰主要包括人抗鼠抗体（HAMA）和类风湿因子（RF）的干扰，这个过程中所使用的特异性阻断剂就是我们通常称之的主动阻断剂，这类主动阻断剂包含一种针对所有类型异嗜性干扰包括HAMA和RF的特异性粘合剂，一旦与干扰抗体结合，通过与干扰物结合而产生空间位阻进一步阻止干扰物与分析物质结合。在实际使用过程中，主动阻断剂的使用浓度通常低于被动阻断剂，从而可以减少由于过量使用被动型阻断剂而引起的检测信号减小等负作用。

（3）专门用于IgM检测试验的阻断剂

    IgM抗体是机体免疫系统对于感染应答所产生的第一种类型的抗体，IgM的检测是帮助识别早期和近期感染有价值的诊断指标。然而，IgM抗体仅占体内总抗体的5%至10%。与此相反，IgG抗体是体内含量最丰富的免疫球蛋白，它占了体内总抗体的约75%至80%。为了确保IgM的检测的敏感性和特异性，阻断含量丰富的IgG抗体和其它非特异性蛋白质，如类风湿因子等对于IgM的检测的干扰是十分必要的。现在通常使用的IgG吸附剂是纯化的山羊抗-人IgG（GAH IgG）的Fc片段，在IgM抗体检测之前去除人血标本中的IgG以及IgG/类风湿因子（RF）结合物，可以显著提高的IgM检测方法的灵敏度。

    在体外诊断试剂行业中，通常用的固相封闭剂大多是使用非靶标蛋白按照一定比例配合而成的缓冲液，具体的包括牛血清，马血清，羊血清等动物血清，酪蛋白等非血清蛋白，牛血清白蛋白等通用无关蛋白。出于成本考虑，大多成熟的，有一定研发生产规模的体外诊断试剂生产厂家，在研发生产过程中大多会使用自有体系配制的固相封闭缓冲液；通常使用的被动阻断剂大多为其他动物IgG，如羊IgG，兔IgG等；而通常具有知识产权保护的主动阻断剂中一般含有鼠IgG抗体及其他清洁抗体。

    在我国体外诊断试剂行业的发展初期，各体外诊断试剂生产厂家并没有充分认识到阻断剂的重要性，大多数体外诊断试剂公司一般根据生产需求简单配制，在重复性，稳定性，使用效果方面参差不齐，导致国内研发生产的体外诊断试剂在临床应用性能上与国外进口品牌有一定差距，假阳性，假阴性的结果难以消除。但是随着我国体外诊断试剂行业的快速发展，行业细分越来越明显，市场冲击越来越大，国内体外诊断试剂生产公司越来越清楚地认识到产品质量才是能持续发展的最重要因素，因此他们不仅仅越来越重视研发生产所使用的抗原抗体，也越来越看重影响试剂品质的各个环节，更多的生产厂家开始接受商业化的封闭剂，阻断剂。目前在市场上认可度比较高的主动阻断剂的商业品牌有Roche的MARK33系列，Scantibodies的HBR系列，Meridian的TRUBLOCK系列，Millipore的CHEMIBLOCK系列，菲鹏的HIER系列等等。

2. 蛋白保护剂

蛋白质（protein）是生命的物质基础。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质，机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质分子由亲水和疏水氨基酸组成，这样的一种组成使得蛋白质在水溶液中会自然折叠，让更多的疏水氨基酸折叠聚集在球形蛋白质内部，而让更多的极性氨基酸暴露在能与水结合的表面。其他起到交联效果的相互作用力包括静电作用、氢键、范德华力、螯合作用以及共价键（比如：二硫键）。其中一些相互作用力对于诸如冷冻、干燥等相变产生的影响非常敏感。

在体外诊断试剂所用的原料中，抗体、抗原、酶等蛋白质是最为重要的关键原料。其所具有的特异性结合、催化反应功能，对在预处理、贮存、使用加工等操作过程中存在的潜在有害影响非常敏感。保存在密封、干燥的环境将有助于确保长时间的稳定，但除非蛋白得到适当的保护，否则干燥过程有也可能使蛋白发生严重的变性。而保存在溶液状态，潜在的危害因素将会增多。比如很简单的一个方面，pH值或者缓冲溶液的改变就能够使蛋白在溶液中的稳定性明显不同。使某种溶液状态稳定的方法并不一定就对另一种溶液有效。在生产过程中的其他因素也有可能影响产品的性能。这些因素包括原料来源、稀释和定时错误、温湿度不合适、曝光和容器材料等。为了保证诊断检测的有效期和精确性，这些原料蛋白必须保持稳定和有效。因此，在诊断试剂中必须要添加适当的，适量的蛋白保护剂。

（1）影响稳定性的原因

1.1 干燥状态稳定性

尽管大多数蛋白质在溶液状态的自然构象下发挥作用，但干燥或者冷冻状态仍然是稳定保存的首选。在这些相对稳定的状态下，诸如蛋白酶、氧化剂等有负作用的溶剂与蛋白质的频繁碰撞将会得到最大限度的减少。但是通过干燥或者其他相变方式，比如沉淀和冷冻，将溶剂从蛋白分子中去除，将可能损害蛋白质的功能构造。这些相变可能使通常折叠在分子内部的疏水氨基酸暴露在分子表面，从而造成蛋白质分子通过疏水表面与其他分子结合，导致蛋白质分子的变性。干燥的方式包括自然风干或者冷冻干燥，例如试剂瓶中结合物的干燥、塑料板或者膜材料上包被抗体的干燥。

在要干燥的溶液中加入适当的溶质来防止蛋白质变性是一种非常有效的保持蛋白质稳定的方法。这些溶质的特点是都具有亲水基团，这些基团通过掩盖疏水性氨基酸从而达到稳定蛋白质功能构造的作用。因此，由于在干燥时溶剂的去除会促进蛋白与蛋白，尤其是蛋白与固相表面的相互作用，所以在干燥前加入保护剂非常重要。

无论是干燥方法还是保存条件，想要保持稳定都有很苛刻的要求。当蛋白应用到膜上时，通常要求非常快速的干燥或者冻干，以保持蛋白最佳性能和活力。而对于平板、试管或者微珠的蛋白包被来说，相对于快速干燥，确保组分的彻底干燥则更为重要。为了得到最大限度的有效期，所有干燥后的产品都需要保存在放有干燥剂的密闭容器中。

1.2 溶液状态稳定性

虽然抗体、抗原、酶以及其他诊断用蛋白在水溶液中处于天然的机能状态，但这并不是它们最稳定的状态。在溶液中，有众多的因素影响着蛋白的活性功能：  

l 蛋白质分子变得更加柔韧易折，从而倾向于改变构象。 ·

l 蛋白质分子和其他分子以及容器壁的碰撞频率增加了。 · .

l 微生物污染的可能性增加了。   ·

l 对温度升高和蛋白浓度降低造成的影响更加敏感。 ·  

l 蛋白质更易被氧化。  

通常来说，溶解的蛋白质分子在较低的温度和较高的蛋白浓度下最为稳定。在刚好高于冰点的时候，蛋白质分子拥有较少的动能，而这些动能是蛋白质“摆脱”其能量最低的功能构造所必需的。在溶液中，部分蛋白活性的损失是由容器壁的吸附、寡聚酶的解聚以及氧化剂、水解酶、微生物等痕量污染物对蛋白质的灭活等原因造成的，而在越高的蛋白浓度下（毫克每毫升范围或更高），损失的蛋白活性占蛋白总活性的比例也就越低。

1.3 影响稳定性的其他因素  

蛋白来源、纯化方式以及化学偶联的方法都能影响蛋白试剂的活性和稳定性。例如，碱性磷酸酶的来源就对复合物的稳定性有重大影响；就溶液的稳定保存而言，将所需蛋白与对蛋白有伤害作用的酶（如水解酶、氧化酶）从原料中分离是非常重要的。若要保证溶液稳定，就必须去除或者灭活这些有害酶以及能产生这些酶的微生物。在合成复合物时，大量的化学反应步骤已被证明能使酶和抗体分子之间形成共价键。其中的一些方法对某些酶-抗体复合物的稳定负面影响较低。如果一种酶联复合物丧失了酶联检测的活性但仍保持有酶活力，那么另外选择一种化学偶联方法也许能解决这个稳定性问题。

有时候，被认为是稳定性方面的问题实际上是由其他变数造成的蛋白量不足。也许就是一个很明显的稀释错误。生产商必须弃用那些有可能吸收蛋白或者抑制蛋白活性的容器材料，例如未处理的聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯或者玻璃。聚乙烯和聚丙烯是比较可取的容器材料。有色酶和其他含有氧化金属离子的蛋白溶液不能暴露在阳光下。

（2）蛋白保护剂种类

影响蛋白活性的因素主要有溶液的PH值、盐分和糖分的浓度、微生物的作用及空气的氧化等。针对市场的需要，目前市面上有很多商品化的蛋白保护剂可供临床和科研生产厂家大批量使用，主要用于微孔板的封闭稳定、抗体稀释液、蛋白稀释液、酶稳定液等。选择这些商品化的试剂在研发初期会给部分企业解决很多问题并且节省研发时间。有些企业，出入成本的考虑，也会着手研发自己的蛋白保护液配方以降低成本以及获得更好的效果。目前蛋白保护剂主要包括：多羟基化合物、糖、氨基酸、聚合物、蛋白质等。

2.1多羟基化合物

多羟基化合物用作蛋白的保护剂由来已久，常见的该类保护剂有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可促进冻干处理的过氧化氢酶复性，且随着甘油浓度上升至0.8%时，过氧化氢酶能够完全复性。甘露醇不仅可作为优良的骨架剂使用，而且在一些处方中它能够兼作蛋白质的冻干保护剂。甘露醇对蛋白质的保护作用与其浓度、形态结构有关，而其浓度与结晶形态有时呈一定的关联性；通常认为无定型甘露醇具有使蛋白质稳定的作用，而结晶态的甘露醇则失去保护功能；1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质的聚集，但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质的聚集。

2.2 糖

糖是最常见、使用最广的一类保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂。糖的保护作用与其及蛋白质的种类有关，而双糖是研究最多也是公认最有效的保护剂，其中蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所构成的双糖，化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止蛋白质二级结构改变及贮藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。

糖对蛋白质的保护作用大小有时依赖于其浓度，通常在某个浓度范围内，糖的保护作用随着浓度的升高而增大；当达到某一浓度时，保护作用达到最大值，而此后再增大糖的浓度则保护效果不再显著增加，有时反而会降低。糖获得最大稳定作用的最低浓度是其足够在蛋白质表面形成一个单分子层的浓度。实际上，糖对蛋白质的保护作用不仅取决于糖的总体浓度，而且还与两者的比例有关。

糖的还原性及其它性质（如旋光性）也会影响其对蛋白质的保护作用。葡萄糖、 乳糖、麦芽糖、纤维二糖等还原性糖均有可能与蛋白质上暴露的某些氨基酸残基 发生迈拉德反应（即羰氨反应或棕色反应〕，使制品变黄和蛋白质活性降低；而旋光性不同的麦芽糖糊精对乳酸脱氢酶的保护作用显示出很大差异。

2.3 氨基酸

氨基酸是常见的蛋白质保护剂之一。低浓度的甘氨酸可通过抑制10或100mmol/L磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止蛋白质变性。无定型甘氨酸可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集；结晶型甘氨酸能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏。常用的氨基酸类蛋白质保护剂有脯氨酸、L-色氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。

2.4 聚合物

聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明胶、聚乙烯亚胺等聚合物也常用作为蛋白质的保护剂。通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重性质，如优先从蛋白质表面析出、表面活性、使蛋白质溶液黏度升高从而阻止其他小分子（如糖及多羟基化合物）的结晶、pH值的剧烈变化等。不同聚合度及浓度的聚合物所提供的保护作用不同，如聚合度大的PVP有着较高的玻璃化温度，随着浓度及分子量增加，水溶液的黏度随之变大，蔗糖的玻璃化温度明显升高，对冷冻过程中的蛋白质所起的保护作用随之也有所增加；但聚合度过大时，聚合物会在冷冻过程中结晶，从而失去对蛋白质的保护作用，而且浓度及分子量过大时会增加最终产品的水分，使得蛋白质变得更不稳定。

2.5 蛋白质

蛋白质类保护剂可分为两种：一种是蛋白质制品自身，另一种为外来蛋白质。蛋白质的活性和蛋白质的起始浓度有直接关系。蛋白在高浓度时更不容易降解（>1mg/ml），在低浓度时(<0.1mg/ml)极易降解而失活。当浓度较低时，通常都会加入外来蛋白质作保护剂，如牛血清白蛋白（BSA）是一个经典、优良的蛋白质稳定剂。另一方面，加入的蛋白也可以减少目的蛋白由于管壁吸附所造成的损失。通常蛋白的储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硅烷化容器。

2.6 防腐剂

随着保存时间的延长，蛋白及稳定剂中的氨基酸、糖类等有机物易受到空气、水中微生物的污染。为了防止微生物污染，终浓度0.02% (w/v)的叠氮化钠或终浓度为0.01％(w/v)的硫柳汞可以抑制微生物的生长。 叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的蛋白可以加入叠氮化钠保存。

3 发展与机遇

近年来随着国内诊断试剂厂家技术上的飞速发展，成熟的诊断试剂平台，如：固相定性反应的ELISA平台正逐步向液相定量检测试剂平台更新换代（全自动磁微粒化学发光平台），达到了与世界先进诊断公司相同的技术水平。更高的技术平台对诊断试剂就有更高的要求，这种完全液相的反应体系对于诊断试剂的稳定性、重复性、批间差等指标有了更高的要求。蛋白保护试剂看上去都是一些常规的蛋白以及化合物，但会影响到检测结果的有效性和精确性，还需要各厂家给予更大的重视。蛋白质的稳定机制相当复杂，对缓冲液中各组分配比的研究有待进一步的优化。开发更优越的保护剂配方，提高诊断试剂的质量仍将是现今国内诊断试剂厂家加大研发投入的热点之一。

第四节 总结与展望

全国体外诊断试剂原料市场的2016年，是举世翘望、纷至沓来的一年，Medix、Meridian、BBI先后在中国设立全资子公司，更多原料供应商正摩拳擦掌跃跃欲试，希望尽快以全资姿态进入中国市场，在中国、以中国的方式、为中国客户服务。

原料，是诊断试剂的核心。在绝大多数项目的优质原料乃至顶尖原料唾手可得、原料来源与国际大厂比肩的今天，中国的体外诊断工业可以将更多精力和智慧集中在仪器设备的改进和试剂工艺的优化上，精雕细琢，终能打造蜚声国际的精品。